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目的:甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid cancer,PTC)的发生、发展是一个复杂的病理生理过程,课题组前期研究结果提示夏枯草中熊果酸(ursolic acid,UA)可上调人乳头状甲状腺癌细胞(TPC-1)内抑癌基因PTEN的表达。本研究将进一步探讨UA对PTC的抑制作用及其相关作用机制,为UA的新药开发及临床应用提供实验依据。方法:1.夏枯草中UA的超声提取工艺优化以超声提取时间、料液比、乙醇体积分数为单因素的实验基础上,采用响应曲面法得出夏枯草中UA超声提取的最佳工艺。2.采用最大给药量法(5g/kg.bw),用SPF级ICR小鼠,雌雄各半,按40mL/kg的给药容积进行24小时内单次灌胃给药急性毒性试验,监测UA对小鼠的急性毒性反应和死亡情况。3.夏枯草中UA作用PTC的RNA测序(RNA-Seq)分析将实验分为三组:人正常甲状腺上皮细胞(Nthy-ori3-1)组、TPC-1细胞组、(UA+TPC-1)细胞组,每组三个样本,将各组的细胞总RNA进行提取,对其进行RNA-Seq分析,按照相对表达倍数(FoldChange)≥1.5,P值<0.05的标准筛选出差异表达的基因,然后对这些差异表达的基因进行G0、KEGG功能分析。采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)验证富集通路PI3K中PI3K、AKT1、mTOR、PTEN和NIS mRNA及线粒体凋亡通路中bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA的表达水平,进一步确定所选通路的准确性。4.夏枯草中UA对TPC-1细胞的作用及其机制研究4.1夏枯草中UA对TPC-1细胞增殖作用的影响选取处于对数生长期的Nthy-ori3-1细胞和TPC-1细胞用于实验,首先采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)绘制这两株细胞的生长曲线,得出两株细胞的最佳接种密度;采用不同浓度UA分别干预这两株细胞(对照组0μM;实验组1.5μM 3μM 6μM 12μM24μM),MTT法观察同一时间不同浓度UA和同浓度UA干预不同时间(24h、48h、72h)对Nthy-ori3-1细胞和TPC-1细胞增殖的影响。4.2夏枯草中UA诱导TPC-1细胞凋亡选取处于对数生长期的TPC-1细胞用于实验,采用不同浓度UA干预细胞(阴性对照组、溶媒对照组、UA 3μM、UA 6μM、UA 12μM),应用倒置显微镜观察经UA干预48h后TPC-1细胞形态的变化;采用Hoechst 33342-PI双染荧光显微镜法观察经UA干预48h后TPC-1细胞凋亡的变化;采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测经UA干预24h、48h、72h后TPC-1细胞凋亡的变化;Western blot法检测经UA干预48h后TPC-1细胞中bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表达情况;QRT-PCR实验检测经UA干预48h后TPC-1细胞内bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA表达水平的变化。4.3夏枯草中UA使TPC-1细胞周期阻滞在S期选取处于对数生长期的TPC-1细胞用于实验,采用不同浓度UA干预细胞(阴性对照组、溶媒对照组、UA 3μM、UA 6μM、UA 12μM),流式细胞术(FCM)检测经UA干预不同时间(24h、48h、72h)后TPC-1细胞周期中各时期细胞比例的变化。4.4夏枯草中UA对TPC-1细胞中PI3K/PTEN/NIS/AKT/mTOR通路的影响选取处于对数生长期的TPC-1细胞用于实验,采用不同浓度UA干预细胞(阴性对照组、溶媒对照组、UA 3μM、UA 6μM、UA 12μM),Western blot法检测经UA干预48h后TPC-1细胞中p85-PI3K、p110-PI3K、AKT1、p-AKT1(Thr308)、p-AKT1(Ser473)、m TOR、PTEN、NIS蛋白的表达情况;QRT-PCR实验检测经UA干预48h后TPC-1细胞内PI3K、AKT1、mTOR、PTEN、NIS mRNA表达水平的变化。5.夏枯草中UA对TPC-1细胞裸鼠移植瘤模型的影响选用健康BALB/c-nu/nu雌性裸鼠,右腋下移植TPC-1细胞,移植瘤模型成功后将裸鼠平均分成两组(模型组、UA组),UA组按照250mg/kg体重给药,模型组给予等量的溶媒(羧甲基纤维素钠)处理,每天灌胃给药,给药周期14天。自给药开始至实验结束,每2天测量裸鼠的体重和瘤体大小,最后计算UA对TPC-1细胞裸鼠移植瘤增殖的抑制率。结果:1.夏枯草中UA超声提取工艺优化夏枯草中UA的最佳超声提取工艺为:料液比1:5,超声提取时间1.5h,乙醇体积分数100%。2.UA小鼠24小时内单次灌胃给药急性毒性试验的最大给药量为5g/kg.bw,小鼠给予UA后,未见明显毒性反应和死亡情况,表明UA毒性较小。3.夏枯草中UA作用PTC的RNA测序(RNA-Seq)分析根据设定的标准,得到各组之间的差异基因,由这些差异表达基因富集的KEGG通路得出:与Nthy-ori3-1细胞组比较,TPC-1细胞组上调的通路有:线粒体凋亡通路和PI3K信号通路等;与TPC-1细胞组比较,(UA+TPC-1)细胞组下调的通路有:线粒体凋亡通路和PI3K信号通路等。我们对筛选结果中的PI3K通路及线粒体凋亡通路上的基因进行QRT-PCR的验证,结果显示:与Nthy-ori3-1细胞组比较,TPC-1细胞组内bcl-2PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达增加(P<0.01),bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9PTEN、NISmRNA表达降低(P<0.01);与TPC-1细胞组比较,(UA+TPC-1)细胞组内bcl-2、PI3K、AKT1、mTORmRNA表达水平降低(P<0.05),bax、caspase-3、caspase-8caspase-9、PTEN、NISmRNA表达水平增加(P<0.05),与RNA-seq结果一致,更加确定了PI3K信号通路和线粒体凋亡通路可作为后面的研究方向。4.夏枯草中UA对TPC-1细胞的作用及其机制研究4.1夏枯草中UA对TPC-1细胞增殖作用的影响MTT实验结果显示,Nthy-ori3-1细胞和TPC-1细胞的最佳接种密度为6.67×10~4个/mL;UA对Nthy-ori3-1细胞的增殖没有抑制作用;不同浓度UA均抑制TPC-1细胞的增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),但UA对TPC-1细胞增殖的抑制作用不呈现时间依赖性。4.2夏枯草中UA诱导TPC-1细胞凋亡倒置显微镜可见,与阴性对照组相比,溶媒对照组细胞无明显变化,而UA组的细胞变圆,随着UA浓度的增加,死细胞越来越多,贴壁生长的细胞变稀疏,细胞浆中的颗粒物质增多。Hoechst 33342-PI双染法观察可见,阴性对照组和溶媒对照组无明显凋亡细胞,细胞核正常,淡蓝色荧光,与阴性对照组相比,UA组可见早期凋亡细胞,核固缩或圆株状,亮蓝色荧光,UA浓度为12μM组出现晚期凋亡细胞,核染色质聚集,红色荧光,说明随着UA浓度的增加,细胞凋亡逐渐由早期凋亡变成晚期凋亡。FCM结果显示,UA分别作用TPC-1细胞24、48、72h后,不同浓度组的凋亡率和早期凋亡率比较均有统计学差异(P<0.05);随着浓度的增加,晚期凋亡率增加,但只在UA=12μM时才有统计学差异(P<0.05),提示UA对TPC-1细胞的增殖抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的,且UA诱导TPC-1细胞凋亡不呈现时间依耐性。Western blot结果显示阴性对照组、溶媒对照组与UA组均有bcl-2、bax、caspase-9蛋白的表达,溶媒对照组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);随着UA浓度的提高,bcl-2的表达降低,相反bax、caspase-9蛋白和bax/bcl-2蛋白比值的表达增加,与阴性对照组相比P<0.05,与UA浓度越高TPC-1细胞更易发生凋亡吻合;但阴性对照组、溶媒对照组与UA组均无caspase-3和caspase-8蛋白的表达。QRT-PCR实验发现,阴性对照组、溶媒对照组与UA组均有bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 m RNA的表达,溶媒对照组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);随着UA浓度的提高bcl-2m RNA的表达降低,相反bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和bax/bcl-2 mRNA的比值表达增加,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。4.3夏枯草中UA使TPC-1细胞周期阻滞在S期不同浓度UA干预TPC-1细胞后,细胞周期各时期的细胞比例变化明显,随着UA浓度的提高S期细胞所占比例明显增多,同阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);相同浓度UA分别作用TPC-1细胞不同时间(24h、48h、72h)后,随着时间的增加,S期细胞所占比例明显增多,同阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),说明UA阻滞TPC-1细胞在S期呈一定浓度和时间依耐性。4.4夏枯草中UA对TPC-1细胞中PI3K/PTEN/NIS/AKT/mTOR通路的影响Western blot结果显示,阴性对照组、溶媒对照组、UA组均有p85-PI3K、p110-PI3K、AKT1、p-AKT1(Thr308)、p-AKT1(Ser473)、mTOR、PTEN、NIS蛋白的表达,溶媒对照组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);UA作用于TPC-1细胞48h后,随着UA浓度的增加,p110-PI3K蛋白的表达变化不显著(P>0.05);p85-PI3K蛋白只在UA(12μM)的作用下,表达降低(P<0.05);AKT1蛋白的表达变化不显著(P>0.05);p-AKT1(Thr308)蛋白表达显著降低(P<0.05),且p-AKT1(Thr308)/AKT1比值明显下降(P<0.05);p-AKT1(Ser473)蛋白只在UA=12μM的浓度作用下表达降低(P<0.01),且此时p-AKT1(Ser473)/AKT1比值明显下降(P<0.01);PTEN、NIS蛋白只在UA=6、12μM浓度的作用下,表达增加(P<0.01);m TOR蛋白表达显著降低(P<0.01)。QRT-PCR结果显示,阴性对照组、溶媒对照组、UA组均有PI3K、AKT1、m TOR、PTEN、NIS mRNA的表达,溶媒对照组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);UA作用TPC-1细胞48h后,与阴性对照组相比,PI3K、AKT1、mTOR mRNA的表达水平随着UA浓度的增加而降低(P<0.05),PTEN、NIS mRNA表达水平随着UA浓度的增加而增加(P<0.05)。5.夏枯草中UA对TPC-1细胞裸鼠移植瘤模型的影响实验过程中UA组裸鼠体重有所升高,给药结束后,裸鼠体重约为(22.05±0.99)g,模型组裸鼠在实验过程中体重逐渐下降,给药结束后,体重约为(16.82±0.68)g,与模型组相比,UA组裸鼠体重变化有统计学差异(P<0.01);给药结束时,模型组的移植瘤体积为(3.14±0.12)cm~3,UA组的移植瘤体积为(2.32±0.11)cm~3,与模型组相比,UA组肿瘤体积减小,差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果显示UA可抑制TPC-1细胞裸鼠移植瘤的生长,但UA组对移植瘤的抑制率无统计学差异(P>0.05)。结论:1.UA能抑制TPC-1细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与活化线粒体凋亡通路、阻滞细胞周期在S期、抑制PI3K/PTEN/AKT/mTOR信号通路有关;2.UA能提高TPC-1细胞中NIS的表达,可能会提高TPC-1细胞的摄碘能力,有待于进一步验证;3.UA毒性低,其对TPC-1细胞裸鼠移植瘤有一定的抑制作用,为以后的实验提供理论依据。