酯酶、脂肪酶的筛选、表达和性质表征

来源 :吉林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:andywu2009
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酯酶(Esterase)是一类能够催化酯键形成和断开的水解酶,普遍存在于动物、植物和微生物中,能够参与酯化、转酯及对光活性物质进行动力学拆分等多种反应。微生物酯酶是一类十分重要的工业酶类,其催化反应时不需要辅酶,且具有反应条件温和、方法简单、催化活性高、选择性强、产物易于分离回收等优点,所以酯酶被广泛应用在食品工业、医药工业、化工业、环保和生物防护等领域。由于嗜热酯酶的高温反应活性,以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性,使其广泛应用于食品、医药、制革、石油开采及废物处理等方面。工业用的酯酶多数来源于微生物。传统获得酯酶的方法主要是从土壤中进行多轮筛选,获得产酯酶的菌株,再进行培养优化等,以获得理想菌株。这种方法有一定的局限性,往往产酶量不高,或者达不到工业化的规模。现在多采用基因工程的手段,构建重组质粒,选择合适的表达宿主来获得较高的表达量。本文从Alcanivorax borkumensis SK2(食烷菌,泊库岛食烷菌)、Thermomonospora curvata DSM43183(弯曲高温单孢菌)及Thermotoganaphthophila RUK-10(一种栖热袍菌)三种细菌出发,根据NCBI数据库,从它们的基因组序列中筛选出疑似编码Esterase/Lipase的基因序列,并以此为模板使用Primer5.0软件设计出相应的引物,经PCR获得目的片段;以相应质粒作为载体构建重组质粒;在大肠杆菌中进行表达,选择相应底物测定酶活,并判定是否为Esterase/Lipase。若为Esterase/Lipase,经蛋白纯化后,对其理化性质进行表征,并测定其动力学常数,为以后的相关催化实验打好基础。本文成功筛选并表达出了酯酶ABO-2454、ABO-2108(来自Alcanivoraxborkumensis SK2)和嗜热酯酶Tnap-0664和Tnap-1739(来自Thermotoganaphthophila RUK-10),经过蛋白纯化和酯酶活性测定,最终获得嗜热酯酶Tnap-0664。根据实验结果分析,天然状态下Tnap-0664以四聚体形式存在(单体分子量为43.8kDa),经热处理和阴离子交换层析纯化后,最后的纯化倍数为8.43倍,蛋白回收率为41.97%;Tnap-0664偏好短碳链底物,碳链越长,水解能力越弱;最适温度为≥100℃;最适pH为9.0;Tnap-0664在70、80、90℃下的半衰期分别为150h、120h、20h,由此得出,Tnap-0664有较好的热稳定性;在pH8-10时,仍可保留80%以上的酶活,具有较好的pH稳定性;金属离子稳定性方面,在K+、 Na+存在时,Tnap-0664的酶活力为111.73%和115.77%,说明K+、 Na+能轻微促进酶活,在Ni2+、Mg2+存在时,Tnap-0664的残余活力为73.85%和69.46%,说明Ni2+、Mg2+能轻微抑制酶活,当Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+存在时,酶活被强烈抑制,Tnap-0664的残余活力分别为19%、2.08%、2.44%、3.04%和0%,有EDTA存在时,剩余活力为112%,说明Tnap-0664不是金属离子依赖性的酶。有机溶剂存在时,除乙酸强烈抑制酶活外,实验中涉及的其他溶剂均轻微抑制酶活,说明Tnap-0664有较好的有机溶剂耐受性。Tnap-0664的Km为76.5μM,Kcat为182,500S-1。
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