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目的:尿路感染包括膀胱炎和肾盂肾炎主要由尿路致病性大肠杆菌(UPEC)引起,并且如果早期急性炎症没有控制将会形成慢性持续性感染,肾瘢痕和肾衰竭。因此发现尿路致病性大肠杆菌的主要致病毒力因子及探究它引起尿路感染的致病机制对于预防和治疗尿路感染疾病尤为重要。细胞毒性坏死因子(CNF1)是尿路致病性大肠杆菌关键毒素蛋白,但是它对尿路致病性大肠杆菌的致病机制及宿主的具体防御作用还不清楚。天然免疫应答是宿主有效抵御UPEC感染的主要方式,中性粒细胞和巨噬细胞在急性尿道感染中对细菌清除起主要作用。然而天然免疫应答必须得到有效调控,否则会造成严重的组织损伤。CD36是重要的清道夫受体之一,在巨噬细胞中负责病原体和凋亡细胞清除,因此在宿主免疫防御和动态平衡中发挥重要作用。目前尚未报道细菌毒素对CD36的调节。本论文拟解决以下三个问题:1.系统研究CNF1在急性尿道感染中对细菌清除和组织炎性损伤的作用;2.研究CNF1对巨噬细胞CD36在表达和转录水平的影响;3.研究CNF1对CD36的分子调节机制。方法:1.在UPEC菌株CFT073中引入cnf1基因,构建CNF1的组成型表达菌株(CFT073-CNF1,CFT073-载体作为对照)或者在UPEC菌株UTI89中敲除cnf1基因,构建CNF1的缺失菌株(Δcnf1,UTI89野生菌作为对照),使用肾盂肾炎模型,通过小鼠尿路感染,于不同时间颈椎脱臼处死小鼠,取小鼠肾脏和膀胱组织,组织匀浆,梯度稀释涂板计数组织细菌数。2.利用流式细胞术检测小鼠尿道感染组织中性粒细胞数,中性粒细胞用CD11b和Ly6G标记。取小鼠肾脏和膀胱组织石蜡包埋切片,H&E染色观察组织损伤,水肿和炎性细胞浸润。3.取小鼠肾脏和膀胱冰冻切片免疫荧光染色,检测巨噬细胞CD36表达水平,巨噬细胞吞噬细菌及中性粒细胞吞噬细菌。4.构建CNF1表达质粒,用镍柱方法纯化CNF1蛋白。利用流式细胞术,普通免疫荧光显微镜和共聚焦显微镜检测CNF1蛋白处理的RAW264.7细胞,THP1分化巨噬细胞,腹腔巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞吞噬细菌和荧光标记的乳胶颗粒。5.分别利用Western blotting,实时荧光定量PCR,流式细胞术和共聚焦显微镜技术检测CNF1蛋白处理的巨噬细胞CD36表达水平。6.构建CD36敲除shRNA,包装慢病毒并转入RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选敲除CD36稳定细胞系;以PCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP为载体,构建表达CD36的质粒,包装慢病毒并转入RAW264.7细胞,流式细胞术筛选稳定过表达CD36的RAW264.7细胞系,并利用共聚焦显微镜检测对吞噬细菌的影响;不同浓度CD36抑制剂(SAB)处理RAW264.7并利用共聚焦显微镜检测对吞噬细菌的影响。7.利用Western blotting,实时荧光定量PCR和共聚焦显微镜技术检测巨噬细胞LXRβ和C/EBPα表达水平变化。8.利用CHIP-qPCR检测CNF1对上游转录因子LXRβ和C/EBPα结合CD36基因启动子位点影响。9.Western blotting检测CNF1蛋白是否进入细胞并且Pull down检测CNF1对RhoA,Cdc42和Rac1活化变化。10.利用Western blotting,实时荧光定量PCR和共聚焦显微镜技术检测Cdc42抑制剂,RhoA抑制剂及Rac1抑制剂对巨噬细胞CD36,LXRβ和C/EBPα表达水平影响。结果:1.小鼠尿路感染CFT073-CNF1相对于对照组(CFT073-载体)明显抑制膀胱组织和肾脏组织中细菌的清除;小鼠尿路感染Δcnf1相对于对照组(UTI89野生菌)明显促进膀胱组织和肾脏组织中细菌的清除。2.小鼠尿路感染CFT073-CNF1相对于CFT073空载对照组明显增加中性粒细胞浸润;小鼠尿路感染Δcnf1相对于UTI89野生组减少中性粒细胞浸润。小鼠肾脏和膀胱组织H&E染色,CNF1表达菌株促进组织炎性细胞浸润,加重组织水肿和损伤。3.CNF1表达菌株抑制小鼠组织巨噬细胞CD36表达及抑制组织中巨噬细胞吞噬细菌。4.体外实验,CNF1抑制巨噬细胞非免疫调理吞噬细菌和荧光标记乳胶颗粒。5.CNF1抑制巨噬细胞CD36表达。6.巨噬细胞表达CD36促进吞噬,反之吞噬受抑制。7.CNF1蛋白抑制LXRβ和C/EBPα表达。8.CNF1蛋白抑制上游转录因子LXRβ和C/EBPα与CD36基因启动子结合而抑制CD36基因转录。9.CNF1蛋白进入巨噬细胞并且活化RhoA,Cdc42和Rac1。10.Cdc42抑制剂能逆转CNF1抑制巨噬细胞CD36和LXRβ表达。结论:1.CNF1表达菌和缺失菌通过使用小鼠肾炎模型引起小鼠尿路感染,结果显示CNF1抑制尿路细菌清除,促进炎症和加重组织损伤。2.CD36是巨噬细胞表面清道夫受体。CD36在天然免疫应答中的主要功能是吞噬病原体和吞噬凋亡中性粒细胞。体内和体外实验证明CNF1减少巨噬细胞表面受体CD36的表达,因此抑制UPEC和中性粒细胞的清除。3.CNF1通过抑制CD36上游转录因子LXRβ和C/EBPα的表达,并且减少LXRβ和C/EBPα募集到CD36启动子位点来抑制CD36基因的转录。4.CNF1对巨噬细胞中的RhoA,Cdc42和Rac1均有活化作用,其中Cdc42介导了CNF1对LXRβ表达的下调。