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本研究应用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法检测了213例LAC手术切除标本中CD68+TAMs和CD163+TAMs的分布情况。研究发现LAC组织中浸润的TAMs的定位与患者的预后密切相关。进一步进行了TAMs影响LAC患者预后的机制研究，证实不同组织分布的TAMs是否表达PD-1是影响LAC患者预后的关键因素。尽管PD-L1在LAC细胞中的表达呈现高度异质性，但LAC间质中浸润的PD-1+CD163+TAMs对患者不良预后的影响并不依赖于肿瘤细胞上PD-L1的表达。
本研究主要结果及结论如下：
1.LAC中TAMs亚型分布及临床病理学意义
(1)LAC间质和癌巢中TAMs的分布
免疫荧光(immunofluorescence,IF)显示，大多数CD68+TAMs共同表达促肿瘤型TAMs的标记物CD163。IHC染色分析213个LAC标本中CD68＋TAMs和CD163+TAMs的分布，结果显示TAMs在间质中的分布较肿瘤癌巢中更为常见(p＜0.0001)。
(2)TAMs分布与LAC患者生存的关系
Kaplan-Meier生存分析显示，肿瘤间质中CD68+TAMs浸润数量与患者生存时间缩短有关(p=0.0231)。而肿瘤癌巢中CD68＋TAMs浸润密度与患者存活率呈现显著正相关(p=0.0001)。此外，间质CD163+TAMs密度与患者生存之间存在显著的负相关(p=0.0040)。根据不同免疫表型的比例和分布，进一步评估巨噬细胞浸润的预后意义。结果表明，与CD68+TAMs和CD163+TAMs密度都低的患者相比，CD68+TAMs密度低而CD163+TAMs密度高的患者存活时间更短(p＜0.0001)。无论CD163+TAMs密度高或者低，肿瘤癌巢中CD68+TAMs密度高的患者预后都较好。
(3)TAMs分布与临床病理特征的关系
卡方检验显示，间质CD68+TAMs浸润密度与分化程度(p=0.023)和组织学亚型分类(p=0.047)呈现显著相关。而间质CD163+TAMs浸润密度与淋巴结(lymph node,LN)转移(p=0.007),分化程度(p=0.008)和TNM分期(p=0.005)呈现明显相关性。肿瘤癌巢中CD163+TAMs更多见于男性患者(p=0.0001)。单因素和多因素Cox回归分析显示，肿瘤癌巢中CD68+TAMs密度是LAC患者生存延长的独立预后因素(p=0.001和p＜0.001)，而间质CD163+TAMs数量可作为LAC患者生存降低的独立预后因素(p=0.005和p=0.027)。
2.TAMs影响LAC患者预后的机制探讨
(1)IL-4诱导的巨噬细胞表达高水平PD-1
应用IL-4诱导单核细胞系THP1和U937极化为巨噬细胞，建立体外TAMs诱导模型。进一步通过qRT-PCR、Western blot和IF染色证实IL-4诱导的巨噬细胞表达高水平PD-1和CD163。研究提示PD-1在TAMs的高水平表达可由IL-4介导。
(2)LAC间质TAMs高表达PD-1影响患者预后
①首先应用Lewis肺癌小鼠细胞系皮下注射C57BL/6小鼠建立皮下移植瘤模型。三周后分离皮下移植瘤，应用FCM进行分析检测。结果显示肿瘤组织中存在一部分CD11b+F4/80+的巨噬细胞表达PD-1，而脾脏组织中的巨噬细胞PD-1表达水平较低。小鼠PD-1+TAMs优势表型为CD206+MHC IIlow促肿瘤型。
②应用IHC染色检测213例LAC样本中PD-1的表达分布情况。结果表明在LAC间质和癌巢中均可查见PD-1+细胞。肿瘤间质中浸润的PD-1+细胞密度明显高于癌巢中的细胞密度(p＜0.0001)。IHC和IF双重染色证实间质中CD68+TAMs表达PD-1，而一部分CD163+TAMs也可表达PD-1，提示LAC间质中浸润的PD-1+CD163+TAMs是TAMs的一个特殊的子集。癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析显示在mRNA水平上PD-1的表达与CD68(p＜0.0001)和CD163(p＜0.0001)的表达呈现明显正相关。IHC结果显示肿瘤间质中PD-1+细胞数量与间质CD68+TAMs(p＜0.0001)以及CD163+TAMs(p＜0.0001)的浸润密度呈现明显的正相关，而癌巢中PD-1+细胞数目与TAMs密度不具相关性。以上研究结果表明LAC间质中PD-1+细胞数与ATMs浸润密度密切相关。Kaplan-Meier生存分析显示间质PD-1+细胞密度越高患者预后越差(p=0.0038)。根据间质PD-1+细胞计数和间质CD163+TAMs浸润密度，进一步分析PD-1+TAMs浸润密度与LAC患者预后的关系。结果表明，与间质PD-1+细胞和CD163+TAMs密度均低的患者相比，PD-1+细胞数量高且间质CD163+TAMs密度高的LAC患者存活时间明显缩短(p=0.0001)。卡方检验显示，间质PD-1+细胞浸润密度与分化程度(p=0.0002)和组织学亚型分类(p=0.0001)密切相关。间质PD-1+CD163+TAMs密度与TNM分期相关(p=0.041)。单因素和多因素Cox回归分析显示，肿瘤癌巢中PD-1+细胞密度(p＜0.001和p=0.001)和间质PD-1+CD163+TAMs(p=0.002和p=0.035)是LAC患者的独立预后因素。
(3)TAMs表达PD-1的机制探讨
将小鼠移植瘤分选的PD-1+TAMs和PD-1-TAMs进行RNA芯片分析，探讨TAMs中PD-1上调表达的可能分子机制。芯片数据分析初步显示PD-1+TAMs中IL-4下游JAK-STAT信号通路富集，提示JAK-STAT通路有可能调控TAMs中PD-1的上调表达。
3.LAC细胞PD-L1的异质性表达
(1)LAC细胞PD-L1的表达呈现异质性
应用qRT-PCR、Western blot、IF染色和FCM检测多种LAC细胞系中PD-L1的表达，发现PD-L1在不同LAC细胞系中的表达呈现差异性。应用IHC染色检测213例LAC和149例SCC样本中PD-L1的表达情况。根据传统染色阳性百分比、以肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AMs)上PD-L1表达为内参照的H-score评分和综合染色强度和百分比的IOD值三种方法评估PD-L1的表达情况，与SCC进行对比分析，结果显示无论以何种评估方法进行比较，LAC中PD-L1的表达水平都较低。以上结果表明PD-L1在LAC中的表达水平较低，且呈现异质性。其次，应用IHC染色检测70例配对原发性和转移性样本中PD-L1的表达情况。结果显示当cut-off值为1%和50%时，LAC原发肿瘤与LN转移肿瘤中，无论是N1还是N2，PD-L1的表达水平呈现更高的一致性。上述结果表明，同一患者的不同肿瘤组织中PD-L1的表达存在异质性。
(2)PD-L1表达与LAC患者预后的关系
生存分析显示PD-L1表达与LAC患者生存不具明显相关性，表明PD-L1表达在LAC中的临床预后预测意义不明显。
4.肺腺癌中PD-1+TAMs和肿瘤细胞PD-L1表达联合分析的临床预后意义
(1)基于PD-1/PD-L1的LAC微环境亚型
无论是根据肿瘤癌巢内或间质中的PD-1+细胞密度进行分类时，LAC微环境优势亚型都为II型免疫无知型(低PD-L1和低PD-1+细胞)，分别占比45%(96/213)和27%(57/213)，提示接近三分之一的LAC患者在诊断时可能会出现免疫衰竭，临床治疗上很难取得抗PD-1/PD-L1免疫治疗效果。
(2)微环境亚型与LAC患者预后的关系
无论是根据肿瘤癌巢内还是间质区域的PD-1+细胞密度进行分类，生存分析显示PD-L1高水平表达但PD-1+细胞密度低的Ⅲ型LAC患者预后最好(p=0.0001和p=0.0021)，提示在考虑PD-L1表达的同时综合分析PD-1+细胞密度，对LAC患者生存期和预后的判断具有显著的影响。
(3)基于PD-1+CD163+TAM/PD-L1的微环境亚型与LAC患者预后的关系结果表明间质PD-1+CD163+TAMs对LAC患者不良预后的影响不依赖肿瘤细胞PD-L1的表达。
综上所述，本论文研究结果证实LAC不同组织分布的TAMs对患者预后预测的差异性源于间质和癌巢中TAMs的PD-1表达水平不一致。间质CD163+TAMs表达高水平PD-1，且间质PD-1+CD163+TAMs是LAC患者生存缩短的独立预后因素。TAMs中PD-1的上调表达可能与JAK-STAT信号通路的活化有关。PD-L1在LAC中呈现异质性表达，但间质PD-1+CD163+TAMs对LAC患者不良预后的影响并不依赖肿瘤细胞PD-L1的表达。
本研究主要结果及结论如下：
1.LAC中TAMs亚型分布及临床病理学意义
(1)LAC间质和癌巢中TAMs的分布
免疫荧光(immunofluorescence,IF)显示，大多数CD68+TAMs共同表达促肿瘤型TAMs的标记物CD163。IHC染色分析213个LAC标本中CD68＋TAMs和CD163+TAMs的分布，结果显示TAMs在间质中的分布较肿瘤癌巢中更为常见(p＜0.0001)。
(2)TAMs分布与LAC患者生存的关系
Kaplan-Meier生存分析显示，肿瘤间质中CD68+TAMs浸润数量与患者生存时间缩短有关(p=0.0231)。而肿瘤癌巢中CD68＋TAMs浸润密度与患者存活率呈现显著正相关(p=0.0001)。此外，间质CD163+TAMs密度与患者生存之间存在显著的负相关(p=0.0040)。根据不同免疫表型的比例和分布，进一步评估巨噬细胞浸润的预后意义。结果表明，与CD68+TAMs和CD163+TAMs密度都低的患者相比，CD68+TAMs密度低而CD163+TAMs密度高的患者存活时间更短(p＜0.0001)。无论CD163+TAMs密度高或者低，肿瘤癌巢中CD68+TAMs密度高的患者预后都较好。
(3)TAMs分布与临床病理特征的关系
卡方检验显示，间质CD68+TAMs浸润密度与分化程度(p=0.023)和组织学亚型分类(p=0.047)呈现显著相关。而间质CD163+TAMs浸润密度与淋巴结(lymph node,LN)转移(p=0.007),分化程度(p=0.008)和TNM分期(p=0.005)呈现明显相关性。肿瘤癌巢中CD163+TAMs更多见于男性患者(p=0.0001)。单因素和多因素Cox回归分析显示，肿瘤癌巢中CD68+TAMs密度是LAC患者生存延长的独立预后因素(p=0.001和p＜0.001)，而间质CD163+TAMs数量可作为LAC患者生存降低的独立预后因素(p=0.005和p=0.027)。
2.TAMs影响LAC患者预后的机制探讨
(1)IL-4诱导的巨噬细胞表达高水平PD-1
应用IL-4诱导单核细胞系THP1和U937极化为巨噬细胞，建立体外TAMs诱导模型。进一步通过qRT-PCR、Western blot和IF染色证实IL-4诱导的巨噬细胞表达高水平PD-1和CD163。研究提示PD-1在TAMs的高水平表达可由IL-4介导。
(2)LAC间质TAMs高表达PD-1影响患者预后
①首先应用Lewis肺癌小鼠细胞系皮下注射C57BL/6小鼠建立皮下移植瘤模型。三周后分离皮下移植瘤，应用FCM进行分析检测。结果显示肿瘤组织中存在一部分CD11b+F4/80+的巨噬细胞表达PD-1，而脾脏组织中的巨噬细胞PD-1表达水平较低。小鼠PD-1+TAMs优势表型为CD206+MHC IIlow促肿瘤型。
②应用IHC染色检测213例LAC样本中PD-1的表达分布情况。结果表明在LAC间质和癌巢中均可查见PD-1+细胞。肿瘤间质中浸润的PD-1+细胞密度明显高于癌巢中的细胞密度(p＜0.0001)。IHC和IF双重染色证实间质中CD68+TAMs表达PD-1，而一部分CD163+TAMs也可表达PD-1，提示LAC间质中浸润的PD-1+CD163+TAMs是TAMs的一个特殊的子集。癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析显示在mRNA水平上PD-1的表达与CD68(p＜0.0001)和CD163(p＜0.0001)的表达呈现明显正相关。IHC结果显示肿瘤间质中PD-1+细胞数量与间质CD68+TAMs(p＜0.0001)以及CD163+TAMs(p＜0.0001)的浸润密度呈现明显的正相关，而癌巢中PD-1+细胞数目与TAMs密度不具相关性。以上研究结果表明LAC间质中PD-1+细胞数与ATMs浸润密度密切相关。Kaplan-Meier生存分析显示间质PD-1+细胞密度越高患者预后越差(p=0.0038)。根据间质PD-1+细胞计数和间质CD163+TAMs浸润密度，进一步分析PD-1+TAMs浸润密度与LAC患者预后的关系。结果表明，与间质PD-1+细胞和CD163+TAMs密度均低的患者相比，PD-1+细胞数量高且间质CD163+TAMs密度高的LAC患者存活时间明显缩短(p=0.0001)。卡方检验显示，间质PD-1+细胞浸润密度与分化程度(p=0.0002)和组织学亚型分类(p=0.0001)密切相关。间质PD-1+CD163+TAMs密度与TNM分期相关(p=0.041)。单因素和多因素Cox回归分析显示，肿瘤癌巢中PD-1+细胞密度(p＜0.001和p=0.001)和间质PD-1+CD163+TAMs(p=0.002和p=0.035)是LAC患者的独立预后因素。
(3)TAMs表达PD-1的机制探讨
将小鼠移植瘤分选的PD-1+TAMs和PD-1-TAMs进行RNA芯片分析，探讨TAMs中PD-1上调表达的可能分子机制。芯片数据分析初步显示PD-1+TAMs中IL-4下游JAK-STAT信号通路富集，提示JAK-STAT通路有可能调控TAMs中PD-1的上调表达。
3.LAC细胞PD-L1的异质性表达
(1)LAC细胞PD-L1的表达呈现异质性
应用qRT-PCR、Western blot、IF染色和FCM检测多种LAC细胞系中PD-L1的表达，发现PD-L1在不同LAC细胞系中的表达呈现差异性。应用IHC染色检测213例LAC和149例SCC样本中PD-L1的表达情况。根据传统染色阳性百分比、以肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AMs)上PD-L1表达为内参照的H-score评分和综合染色强度和百分比的IOD值三种方法评估PD-L1的表达情况，与SCC进行对比分析，结果显示无论以何种评估方法进行比较，LAC中PD-L1的表达水平都较低。以上结果表明PD-L1在LAC中的表达水平较低，且呈现异质性。其次，应用IHC染色检测70例配对原发性和转移性样本中PD-L1的表达情况。结果显示当cut-off值为1%和50%时，LAC原发肿瘤与LN转移肿瘤中，无论是N1还是N2，PD-L1的表达水平呈现更高的一致性。上述结果表明，同一患者的不同肿瘤组织中PD-L1的表达存在异质性。
(2)PD-L1表达与LAC患者预后的关系
生存分析显示PD-L1表达与LAC患者生存不具明显相关性，表明PD-L1表达在LAC中的临床预后预测意义不明显。
4.肺腺癌中PD-1+TAMs和肿瘤细胞PD-L1表达联合分析的临床预后意义
(1)基于PD-1/PD-L1的LAC微环境亚型
无论是根据肿瘤癌巢内或间质中的PD-1+细胞密度进行分类时，LAC微环境优势亚型都为II型免疫无知型(低PD-L1和低PD-1+细胞)，分别占比45%(96/213)和27%(57/213)，提示接近三分之一的LAC患者在诊断时可能会出现免疫衰竭，临床治疗上很难取得抗PD-1/PD-L1免疫治疗效果。
(2)微环境亚型与LAC患者预后的关系
无论是根据肿瘤癌巢内还是间质区域的PD-1+细胞密度进行分类，生存分析显示PD-L1高水平表达但PD-1+细胞密度低的Ⅲ型LAC患者预后最好(p=0.0001和p=0.0021)，提示在考虑PD-L1表达的同时综合分析PD-1+细胞密度，对LAC患者生存期和预后的判断具有显著的影响。
(3)基于PD-1+CD163+TAM/PD-L1的微环境亚型与LAC患者预后的关系结果表明间质PD-1+CD163+TAMs对LAC患者不良预后的影响不依赖肿瘤细胞PD-L1的表达。
综上所述，本论文研究结果证实LAC不同组织分布的TAMs对患者预后预测的差异性源于间质和癌巢中TAMs的PD-1表达水平不一致。间质CD163+TAMs表达高水平PD-1，且间质PD-1+CD163+TAMs是LAC患者生存缩短的独立预后因素。TAMs中PD-1的上调表达可能与JAK-STAT信号通路的活化有关。PD-L1在LAC中呈现异质性表达，但间质PD-1+CD163+TAMs对LAC患者不良预后的影响并不依赖肿瘤细胞PD-L1的表达。