研究背景 晚期肾癌对放疗、化疗及激素治疗均不敏感，手术效果不佳，免疫治疗可作为其辅助治疗的一种选择。临床上最常用的是以细胞因子为基础的非特异性免疫治疗对晚期肾癌疗效十分有限，费用昂贵，毒性反应大，并且缺乏靶向性。利用肿瘤相关抗原进行特异性主动免疫治疗成为肿瘤免疫治疗的研究热点。 肾癌G250/MN/CAIX抗原具有良好肿瘤特异性，可作为肾癌，特别是透明细胞癌治疗的一个潜在的靶目标。但单纯肿瘤抗原蛋白或多肽疫苗免疫原性相对较弱，只有同佐剂合用才可引起有效的细胞和体液免疫应答。免疫刺激复合物(ISCOM)作为一种全新的抗原提呈系统是目前研究的热点。 基因重组酿酒酵母疫苗作为一种新型的免疫刺激复合物疫苗，既能作为表达体系完成抗原的加载，又能发挥出佐剂作用诱导机体产生有效的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答，被广泛应用。 目的： 将G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段定向克隆至酿酒酵母表达载体pYES2/NT C，构建pYES2/NT C-G250重组质粒。观察其在酿酒酵母中诱导表达情况。并对其作为基因重组酵母G250瘤苗的意义进行初步探讨。 方法： 1 pYES2/NT C-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒的构建：用HindⅢ及XhoⅠ两种限制性内切酶对质粒pcDNA3.0-G250进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，回收1.5Kb的G250 cDNA片段，并将G250 cDNA片段定向克隆到酿酒酵母穿梭诱导表达质粒pYES2/NT C中相应的多克隆位点，连接产物经菌落PCR、双酶切电泳及序列测定鉴定。 2重组质粒pYES2/NT C-G250转化酿酒酵母： 按Invitrogen S．c．Easycomptransformation试剂盒说明书制备酿酒酵母感受态细胞，加入1-3ug重组pYES2/NTC-G250进行转化，尿嘧啶筛选出阳性转化子并鉴定。 3 pYES2/NT C-G250在酿酒酵母中的诱导表达： 将阳性克隆单菌落扩增后接种于含2﹪半乳糖的Sc-ura培养液，分别于诱导表达0，4，8，12，16h后收集酵母菌，抽提蛋白。 4表达产物的免疫印迹分析： 取以上各时间点的样品进行SDS PAGE电泳后，电转印到硝酸纤维素膜(NC)上，应用抗G250特异性抗体进行免疫印迹分析。 结果 1 pYES2/NT C-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒的构建： HindⅢ和XhoⅠ酶切鉴定结果显示G250 cDNA片段(1.5Kb)己克隆入酿酒酵母诱导表达质粒pYES2/NT C，序列测定结果与已知序列同源性100﹪． 2酿酒酵母的pYES2/NT C-G250质粒转化及阳性转化子的筛选： 感受态酿酒酵母菌转化重组质粒后，经尿嘧啶筛选出阳性转化子，菌落PCR及质粒序列测定显示转化成功。 3 pYES2/NT C-G250在酿酒酵母INVScl中的诱导表达和Western印迹分析： 携重组质粒pYES2/NT C-G250的宿主菌INVScl进行半乳糖诱导表达，菌体裂解物应用抗G250特异性抗体进行Western印迹分析。结果显示，重组工程菌可表达G250蛋白，且在半乳糖诱导表达约8-12小时达高峰结论成功构建pYES2/NT C-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒，证实其能够在酿酒酵母中诱导表达，表达量随诱导时间而变化，8-12h达高峰。这为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗在体内外的抗肾细胞癌肿瘤效应及评估瘤苗的安全性打下了良好的基础。