精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)表面标记基因遗传信息及其产物蛋白的抗体在精原干细胞研究中占有举足轻重的地位。表面标记基因的cDNA序列可用于SSCs的转录表达鉴定，其翻译产物表面标记抗体可用于流式细胞仪分离纯化SSCs，或者用于SSCs的免疫荧光染色鉴定。大动物SSCs的长期纯化培养至今没有成功的报道，跟SSCs表面标记分子的DNA序列及抗体的缺乏有一定的关系。GFRα1是SSCs细胞膜上的GDNF受体蛋白，也是精原干细胞(SSCs)的表面标记基因之一，在调节SSCs的增殖和分化过程中扮演着重要的角色。GDNF通过SSCs膜表面的GFRα1受体介导与RET蛋白结合，引起RET二聚化及酪氨酸残基位点发生自磷酸化启动下游信号通路，促进SSCs的自我更新。至今为止，绵羊的Gfrα1基因序列还没有报道，影响了绵羊SSCs的深入研究。所以有必要对绵羊Gfrα1基因进行研究，为绵羊精子发生过程的研究和精原干细胞的分离纯化培养鉴定奠定基础。　　 1、绵羊Gfrα1基因的克隆　　 比较公布的人、大鼠、小鼠、牛、黑猩猩的Gfrα1基因的核苷酸序列，找到保守区设计PCR引物，以绵羊睾丸组织cDNA为模板，用RT-PCR法扩增得到约1041bp的绵羊Gfrα1基因中段片段，将扩增的产物连接到pMD-19T载体上然后测序。根据Gfrα1cDNA编码区的中段和牛的Gfrα1基因序列再设计一对引物用于克隆Gfrα1cDNA编码区的前段。将Gfrα1基因编码区的前段和中段的测序结果通过软件拼接。克隆得到的绵羊Gfrα1基因的大部分cDNA序列包括起始密码子在内共1312bp，包括1311bp的开放阅读框(ORF)，编码437个氨基酸，与牛、人、黑猩猩、大鼠和小鼠相应核苷酸序列的同源性分别为98.5％、91.3％、91.0％、88.9％和88.0％。这说明进化过程中Gfrα1基因序列具有高度保守性，而绵羊作为反刍动物在Gfrα1基因序列上具有种属特异性。　　 2、构建原核表达载体及抗原表位多肽的制备与纯化　　 根据测得的cDNA序列，用软件预测已知片段的抗原表位区。采用PCR方法扩增得到Gfrα1抗原表位DNA片段。将抗原表位片段插入pET-44a(+)表达载体，获得重组质粒pET-44a-Gfra1，Gfrα1抗原表位DNA片段与表达载体的his-tag连接，形成his-Gfra1融合多肽表达框。pET-44a-Gfra1重组质粒转化得到pET-44a-Gfra1重组菌。分析重组菌表达his-Gfra1多肽的最佳条件为用1mMIPTG诱导8小时。经过扩大培养重组菌，收取菌体制备细胞裂解液，并通过Ni-NTA柱层析，纯化制备his-Gfrα1融合多肽。经Westernblot鉴定，his-Gfrα1融合多肽分子量约为18.2KD，与预测的大小一致。本研究成功地在大肠杆菌中实现了绵羊Gfrα1基因抗原表位多肽的表达，并且获得了纯化的Gfrα1基因抗原表位多肽，为下一步制备多克隆抗体打好了基础。　　 3、用S180腹水瘤细胞刺激产生多克隆抗体及多克隆抗体的鉴定　　 将纯化的his-Gfra1抗原表位多肽免疫6-8周的C57小鼠，共免疫5次，每次间隔12天。末次免疫后一周，小鼠腹腔注射S180细胞，刺激产生腹水制备Gfrα1的多克隆抗体，待小鼠腹部增大收集腹水获得Gfrα1多克隆抗体。经间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，证明本实验制备的多克隆抗体效价为1∶800，具有较高的特异性，绵羊睾丸组织GFRα1蛋白免疫印迹分析实验(westernblotting)检测结果显示，在50KD左右有特异性条带产生，这与预测的GFRα1蛋白的大小一致，说明制备的抗体确实能和绵羊睾丸组织全蛋白中的GFRα1蛋白结合。证明本实验制备的多克隆抗体具有较高的特异性。　　 4、应用绵羊GFRα1多克隆抗体鉴定体外培养的绵羊SSCs　　 对本实验室体外长期培养的绵羊SSCs细胞进行GFRα1和PLZF双免疫荧光染色，所使用的抗体为本实验制备的GFRα1抗体和市售的PLZF抗体。前人研究报道已证实PLZF是绵羊SSCs特异的标记分子。用PLZF抗体对长期培养的SSCs进行免疫荧光染色，SSCs显示阳性，而滋养层细胞呈阴性，证明本实验室得到了长期培养的绵羊SSCs。用本室自制的GFRα1抗体与PLZF抗体对长期培养的绵羊精原干细胞进行免疫荧光双标染色，结果显示这两种抗体免疫荧光染色的细胞完全重叠。上述结果例证了本实验室自制的GFRα1抗体能够作为绵羊SSCs的标记分子，用于绵羊SSCs的鉴定分析。本研究结果为开展绵羊SSCs的研究和操作提供了分析鉴定手段，对绵羊SSCs的形态和分布研究以及应用SSCs操作方法开展绵羊遗传育种研究和转基因技术研究具有重要意义。