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α-酮缬氨酸（KIV）是生物合成中的重要中间体,广泛应用于食品、饲料、医药和化学合成等行业。目前,KIV可通过化学合成法、微生物发酵法和酶转化法合成。化学法合成KIV步骤多,且需要苛刻的生产条件。微生物发酵法存在发酵周期长、产量低等缺点。相比而言,酶转化法具有底物转化率高、产量高、产物易分离、环境污染小等优点,适合KIV的生产。本研究以大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）为宿主,对来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶（PmLAAD）进行异源表达,从而构建了重组菌株E.coli BL21（pET-28a-Pm LAAD）,利用该酶催化底物L-缬氨酸（L-Val）合成产物KIV,并利用蛋白质工程改造、菌株产酶条件优化、全细胞转化条件优化以及罐上转化条件优化等手段进一步提高了L-氨基酸脱氨酶合成KIV的效率,论文主要内容如下:（1）成功构建了含有L-氨基酸脱氨酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21（pET-28a-PmLAAD）,该基因来源于P.mirabilis。利用重组菌株催化底物L-Val制备KIV,评估结果表明,当底物浓度超过20 g·L-1时,转化率无法达到95%以上,进一步考察了底物浓度、全细胞催化剂浓度以及初始产物添加量对PmLAAD全细胞转化的影响,发现底物浓度对转化反应影响不大,且增加催化剂浓度并不能提高KIV产量,但是随着初始产物添加量的增多,全细胞转化反应变慢,表明产物抑制是LAAD全细胞转化的限速步骤。（2）蛋白质工程改造PmLAAD缓解产物抑制从而提高转化效果。利用SWISS-MODEL同源建模得到PmLAAD的蛋白结构模型。结构分析确定关键残基位于产物结合位点周围6个Loop环上;对候选残基进行定点饱和突变,高通量筛选获得了四个产量高于野生型的突变体,分别为S98A、T105A、S106A和L341A。其中S98A产量最高,为46.9 g·L-1,将上述单突变体进行组合,筛选获得KIV产量进一步提高的四突变体PmLAADM4（S98A/T105A/S106A/L341A）,KIV产量可达到66.7 g·L-1,比野生型提高了67.5%。对突变体进行动力学参数测定和产物抑制常数测定,最佳突变体PmLAADM4的催化效率和产物抑制常数分别比野生型提高了6.2倍和6.7倍。在70 g·L-1底物以及40 g·L-1初始产物的条件下,突变体获得的KIV产量、转化率、酶活以及KIV生产速率明显优于野生型。计算机模拟分析发现突变体PmLAADM4中S98A减弱了酶与产物的结合,T105A、S106A和L341A促进了产物释放的速度。（3）优化最优突变酶PmLAADM4的产酶条件和摇瓶转化条件,确定了最佳的产酶条件:表达载体pACYCDuet-1,发酵培养基TB,诱导OD600 0.8,诱导时间12 h,IPTG0.4 mmol·L-1,诱导温度25 oC。确定了最佳的转化条件:温度30 oC,pH 8.5,此时,KIV的产量为86.5 g·L-1。进一步在5 L罐的1 L体系下进行全细胞转化条件优化。确定了最适全细胞催化剂浓度为10 g·L-1,转化过程中最佳搅拌转速为600 rpm,最佳通气量为1.5vvm,最适底物投料量为100 g·L-1,最佳转化时间为18 h,KIV最高产量达98.5 g·L-1,转化率为99%。