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赭曲霉毒素A(OchratoxinA.OTA)是指自然条件下在大麦,玉米等粮食作物被青霉菌、曲霉菌等污染后,产生的一种毒性危害大、可致突变、致畸和致癌的小分子化合物,建立高灵敏监控手段是防止OTA污染食品进入人类食物链的有效措施之一。酶联免疫吸附方法(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)是用于OTA筛查检测最常用方法,但建立检测OTA的ELISA方法需要大量使用OTA毒素合成竞争抗原,大量接触毒素对操作人员存在潜在的危害,因此寻找OTA毒素替代物,并建立简便、快速、高灵敏的OTA的筛查方法具有重要意义。本研究利用商业化的噬菌体随机七肽库,通过改进的淘选方法,得到了与抗OTA单克隆抗体2A11特异性结合的噬菌体模拟表位肽序列,并以此核心序列为模板,合成生物素化的肽段(生物素化的模拟抗原)为竞争抗原,建立了无噬菌体的直接竞争ELISA方法,并应用于玉米提取液中OTA的定量检测。具体研究过程如下:首先以驴抗鼠二抗包被酶标孔,并进一步定向结合抗OTA单克隆抗体2A11。加入噬菌体随机七肽库与单抗结合,前三轮富集采用酸洗脱,第四轮富集采用超低浓度的OTA(0.1ng/mL)竞争洗脱。经鉴定随机挑选的30个噬菌体粒子均为与抗体2A11具有结合能力的阳性噬菌体粒子,其中16个噬菌体粒子在OTA浓度为0.1ng/m L显示较高的竞争抑制率。挑选这16株噬菌体测序,得到6个不同的肽段序列。其中序列为“GMVQTIF”的噬菌体粒子具有最高的检测灵敏度。其次,以GMVQTIF序列为模板,合成生物素化的12肽(生物素化的模拟抗原)“GMVQTIF-GGGSK-biotin”为竞争抗原,建立直接竞争ELISA。在最优的条件下,基于模拟肽为竞争抗原的ELISA检测OTA的线性范围为0.005ng/mL—0.2ng/mL,半数抑制浓度(IC50值)为0.024ng/m L,最低检出限为0.001ng/m L,与商业化ELISA试剂盒相比灵敏度提高了5倍。通过BLI分析了生物素化的模拟肽和OTA全抗原与抗体的亲和常数,结果表明抗体2A11与生物素化的模拟表位亲和力远低于与普通OTA全抗原亲和力。特异性实验表明,本实验建立的ELISA方法与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇以及玉米赤霉烯酮无交叉反应。加标回收实验结果显示,该方法检测玉米加标样品批内回收率在98.7%-120.3%,变异系数在3%-10%之间,批间回收率在97.4%-105.2%之间,批间变异系数8%-20%,以上数据表明本实验方法具有良好的特异性及精密度。进一步将该方法与商业化ELISA试剂盒检测数据进行相关性分析,显示两种ELISA方法具有良好的相关性,表明本实验获得的“GMVQTIF-GGGSK-biotin”可以替代OTA作为竞争抗原建立无噬菌体的直接竞争ELISA方法,并用于玉米样本中OTA的高灵敏检测。