结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis，Mtb)感染引起的慢性传染病，其发病率和死亡率均居重大传染病前列，严重威胁人类的健康和生命。据世界卫生组织2012年全球结核病报告:2011年全球估计有870万新发结核病例。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，现有结核病患者约500万人，仅次于印度居世界第二位。这些数据说明，控制结核的新发病例数仍是当前重要的工作之一。Mtb是典型的胞内寄生菌，在感染早期主要寄生在肺泡巨噬细胞内，感染晚期主要寄生在肺巨噬细胞和树突状细胞内。因此，体内的单核/巨噬细胞系统既是抵抗Mtb感染的第一道防线，也是最关键的一道防线。Mtb被巨噬细胞的吞噬过程主要由Toll样受体(TLRs)介导。故研究早期天然免疫中TLRs与Mtb之间的关系，有利于了解机体在结核感染最初的免疫反应。　　 TLRs是一群主要分布在单核-巨噬细胞膜表面的跨膜蛋白受体，能识别细菌、病毒等多种病原体，也是巨噬细胞最早接触Mtb的抗原递呈分子，TLRs的活化程度在细胞吞噬病原微生物及随后的免疫应答反应中发挥着重要的作用。迄今为止，人类已发现11个Toll样受体家族成员(TLR1-11)，其中TLR2及其信号通路在抗结核免疫中起着关键作用。现已证实TLR2可以由多种结核胞壁蛋白、菌体等激活，将Mtb感染的信号传导至细胞内，通过信号传导使髓样分化蛋白88(MyD88)活化，核转录因子(NF-κB)激活，释放炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α、和IFN-γ，参与机体早期免疫反应。同时诱导未接触抗原的T细胞活化，并产生共同刺激分子B7.1，从而进一步诱导机体的特异性免疫应答。因此TLR2及其信号通路被认为是机体产生针对结核分枝杆菌非特异性和特异性免疫应答的重要途径。因为TLR2与结核杆菌感染的关系密切，近年来，有诸多学者致力于研究TLR2的结构、表达与功能之间的联系，以明确TLR2从相应受体到功能的意义。众多的实验表明，无论是在体外Mtb感染细胞实验还是分离结核病人外周血，TLR2基因mRNA表达水平均上调，但这种上调的机制以及TLR2基因本身的上游调控因子仍不十分清楚。　　 目前已有的研究报道显示，鸟结核分枝杆菌感染小鼠的巨噬细胞后，TLR2表达上调，并且这种上调作用受到TLR2基因启动子上游的NF-κB和Sp1反应元件共同介导。但是人类TLR2基因与小鼠的TLR2基因结构有很大不同，上游启动子序列也不尽相同。因此，鉴定人类TLR2基因启动子上游的具有功能性的反应元件，并且阐明其在结核杆菌感染中的作用机制至关重要。　　 本研究以卡介苗(BCG)，一种减毒结核杆菌为刺激因素，探讨BCG对TLR2基因表达的影响及其作用机制。通过分析TLR2基因启动子结构，我们鉴定了TLR2启动子区的一个AP-2a反应元件，并证明了BCG感染通过增加AP-2a的表达，从而使更多的AP-2a蛋白参与到AP-2a位点的蛋白质复合物中，改变其DNA亲和力来调节TLR2启动子活性，从而调控TLR2mRNA和蛋白质的表达。本研究的发现不仅对深入了解TLR2基因功能有重要意义，而且将为阐明结核病的发病机制，预防和综合控制结核病的传播提供新思路。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、人淋巴瘤白血病单核细胞系THP-1;　　 2、刺激药物:氟波酯PMA;　　 3、RNA提取相关试剂、RT试剂盒及Real-time PCR相关试剂;;　　 4、基因重组及萤光素酶报告基因检测相关试剂及试剂盒;　　 5、电泳泳动迁移实验(EMSA)及染色质免疫沉淀（ChIP）相关试剂;　　 6、Western blot相关试剂。　　 二、实验方法：　　 1、Real-time PCR检测BCG感染前后TLR2 mRNA和蛋白表达水平的变化;　　 2、利用生物信息学软件分析TLR2基因启动子结构，构建TLR2启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体，应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性，鉴定TLR2基因启动子关键的转录调控区;　　 3、EMSA方法体外鉴定TLR2基因启动子内activator protein-2 alpha(AP-2α)反应元件;ChIP实验进一步在体内条件下验证AP-2α与该位点的结合。　　 4、应用双荧光素酶活性检测RNA干涉敲减AP-2α转录因子对TLR2启动子活性的影响;　　 5、Real time RT-PCR检测BCG感染对RNA干涉敲减AP-2α后TLR2mRNA表达水平的影响。　　 6、应用双荧光素酶活性检测BCG感染对RNA干涉敲减AP-2α后TLR2启动子活性的影响;　　 7、Western blot检测BCG感染对转录因子AP-2α蛋白表达水平的影响。　　 结果：　　 1、Real-time PCR结果表明BCG感染上调TLR2 mRNA的表达水平;Western印迹杂交显示THP-1细胞中TLR2蛋白在BCG感染后上调;　　 2、ALiBaba2.1和TRANSFAC TESS软件预测及荧光素酶报告基因分析结果显示TLR2启动子区-190～-140区域是该基因关键的转录调控区;　　 3、EMSA实验在体外条件下证明了TLR2启动子-184～-172区存在AP-2α反应元件;CHIP实验进一步在体内条件下获得了相同的结果;　　 4、荧光素酶报告基因检测结果显示抑制内源性AP-2α表达降低了细胞TLR2基因启动子活性;　　 5、Real-time PCR结果表明在BCG感染条件下，RNAi敲减AP-2α，TLR2基因mRNA表达降低;　　 6、荧光素酶报告基因检测结果显示在BCG感染条件下，RNAi敲减AP-2α，TLR2基因启动子活性降低;　　 7、Western blot实验结果提示BCG感染可上调转录因子AP-2α蛋白表达。　　 结论：　　 1、BCG感染可以上调TLR2基因mRNA和蛋白表达水平;　　 2、TLR2基因启动子184～-172区域存在AP-2a反应元件;　　 3、AP-2a反应元件对TLR2启动子的基础转录活性起关键作用，并介导BCG感染对TLR2基因表达水平的上调;　　 4、BCG感染增加了AP-2a蛋白表达水平，增强了AP-2a与反应元件的结合，这是BCG感染使TLR2基因表达水平上调的可能机制。