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NAC(NAM/ATAF/CUC)转录因子是植物特有的转录调控因子,也是植物中最大的基因家族之一。NAC保守域的名称最初来源于矮牵牛NAM基因,拟南芥ATAF1、ATAF2和CUC基因的共有序列。NAC转录因子家族基因在植物生长发育、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫、及作物产量和品质等方面发挥重要作用。其N端含有高度保守的DNA结合区,即NAM保守结构域,C端则高度变异,为转录激活区。
小麦是重要的粮食作物,为世界数目众多的人口提供膳食营养,但是外部环境刺激和植物自身的遗传严重影响小麦的产量和质量。相比拟南芥和水稻,小麦NAC转录因子的研究相对较少,且多数研究集中在衰老和品质方面。本文系统研究了小麦‘京冬17’的15个NAC基因的分子特征,旨在挖掘潜在的抵抗逆境胁迫的,与发育密切相关的,及具有多种功能的优势基因,为基因工程改良农作物品质,提高植株的产量、抗逆性能提供良好的基础。
本实验通过同源克隆的方法,从四种胁迫处理的小麦叶片(旱,盐,冷,ABA)及小麦不同器官(四叶期的叶片,根,茎,灌浆期的未成熟种子和衰老叶片)提取的总RNA中成功分离得到15个编码NAC转录因子的基因全长,本实验主要研究内容及结果如下:
1. 通过构建系统进化树并结合已知的NAC基因的功能、对小麦NAC基因进行了分类和初步的功能预测,结果表明本实验克隆得到的NAC基因主要可以分为三大类,逆境胁迫相关NAC,发育相关NAC,及跨膜NAC,其中3个跨膜NAC为小麦中首次发现的NAC类跨膜转录因子。
2. 利用半定量RT-PCR方法分析了TaNAC基因在干旱、高盐、低温和ABA处理下的表达情况,同时分析了它们的组织表达特异性。结果表明:TaNAC3,TaNAC4,TaNAC6,TaNAC12受一种以上胁迫处理诱导表达强烈;TaNAC5,TaNAC7,TaNAC8 受胁迫诱导表达,但是转录水平Mrna表达量非常低;
TaNAC9,TaNAC10,TaNAC11,TaNTL1,TaNTL2 受胁迫诱导明显下调,由此可见,这些基因很可能在抗逆胁迫中发挥作用。在所检测的15个基因中,除TaNAC5,TaNAC7和TaNAC10,在各个组织中的表达量基本一致之外,其他基因在不同组织表现出明显的表达差异。我们推测这些基因可能在植物器官建成和形态发育过程发挥作用。
3.基因枪法转化洋葱表皮细胞瞬时表达实验表明,TaNAC-GFP融合蛋白包括TaNAC1,TaNAC2,TaNAC3,TaNAC4,TaNAC5,TaNAC6,TaNAC7,TaNAC8,TaNAC12特异定位在细胞核中,它们是典型的转录因子;对于TaNTL1-GFP融合蛋白,全长基因融合蛋白主要定位在细胞膜上,极少部分定位在细胞核上,跨膜域缺失片段融合蛋白特异定位在细胞核中,因此TaNTL1作为跨膜转录因子行使功能,此外分析认为TaNTL2,TaNTL3 同为跨膜转录因子。
4. 酵母转录激活实验、显色反应证明在酵母株系AH109体内,TaNAC2,TaNAC3,TaNAC4,TaNAC6,TaNAC8,TaNAC9,TaNTL1,TaNTL2,TaNTL3具有转录激活活性;TaNAC1,TaNAC5,TaNAC7,TaNAC10,TaNAC11,TaNAC12无转录激活活性。