东北核桃楸种仁蛋白提取及降血压肽制备的研究

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核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)种仁中富含多种营养成分,除油脂外蛋白质含量也尤为丰富。本试验以东北核桃楸种仁为原料,比较了2各省份不同产地(绥芬河、牡丹江、伊春、白山)的4种核桃楸种仁营养成分及氨基酸含量。根据各样品营养成分及出仁率的比较,确定牡丹江和白山的2个样品较为优良。对二者进行氨基酸比较分析可知,牡丹江样品相对于白山样品具有较高的营养价值,确定其为后续试验原料。按照Osboren蛋白质分类法对东北核桃楸种仁蛋白分类,结果表明谷蛋白含量最多为79.49%,清蛋白含量为5.68%,球蛋白含量为4.67%,最后为醇溶谷蛋白,含量为0.87%。对以上4种蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,得知清蛋白分子量主要集中在88kDa、61kDa、41kDa、23kDa4个分子量区域,球蛋白分子量主要基中在94kDa、59kDa、41kDa、24kDa、20kDa5个分子量区域,醇溶谷蛋白分子量主要集中在101kDa、59kDa、40kDa、27kDa、19kDa5个分子量区域,谷蛋白分子量主要集中在112kDa、68kDa、44kDa、20kDa4个分子量区域。采用碱提法对东北核桃楸种仁进行蛋白质的提取,根据单因素试验和正交试验,得到碱溶性东北核桃楸种仁蛋白最佳提取条件为:提取液NaOH浓度为0.02mol/L,料液比为1:30,提取温度为50℃,提取时间为1.5h,此条件下碱溶性东北核桃楸种仁蛋白提取率最大为88.05%,其等电点为4.5。选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶3种蛋白酶,对2%的东北核桃楸种仁蛋白液酶解,以水解度和ACE抑制率为指标,进行比较分析,确定碱性蛋白酶为最佳酶制剂,其水解得到的水解物ACE抑制率最高达61.58%。通过单因素和响应面试验优化碱性蛋白酶酶解制备东北核桃楸种仁蛋白降血压肽的工艺。确定得到ACE抑制率最佳的条件为pH8.2、温度56℃C、时间4h、加酶量5880U/g底物,此时水解度为29.03%,水解物的ACE抑制率为72.48%。通过对核桃楸种仁蛋白降血压肽进行超滤处理(截留分子量5000),发现经超滤后的透过液(IC50=1.196mg/ml)AEC抑制率为88.917%,比原来多肽液提高了17.699%。将透过液冻干后,采用SephadexG-15凝胶层析对降血压肽进一步纯化,可以得到3个峰值,分别对峰值下的组分进行ACE抑制率测定比较,得知组分2(IC5o=0.474mg/ml)的ACE抑制率最高为62.235%,降压效果最好。利用纯化后的降血压肽进行细胞试验,对人脐静脉内皮细胞培养进行观察,并测定细胞NO、ET释放的含量,证明东北核桃楸种仁蛋白降血压肽在一定浓度范围具有与降血压药物卡托普利相似的降压作用,能够促进人脐静脉内皮细胞释放NO,而降低ET释放。
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