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谷氨酰胺合成酶(GS)是生物体内氮代谢的关键酶,当存在ATP水解生成ADP供能时,GS能够催化氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。不但在工业生产中能够利用GS催化合成L-谷氨酰胺、茶氨酸等极具市场价值的产品,而且GS在转基因植物中的大量表达还可以显著地提高相应植株的草铵膦耐受性,同时还能够赋予转基因植株抗土壤氮素贫瘠、抗旱耐盐和抗强光照等特性。本研究从极端环境微生物中筛选得到一株具有高GS活性的海洋菌株Exiguobacterium sp.N10-1,根据NCBI数据库中相关基因序列设计引物扩增得到exiGS基因。exiGS基因由1341bp构成,编码446个氨基酸,预测得到的蛋白质分子量为50.1kDa。exiGS基因所编码的蛋白序列与已报道的GS蛋白最高一致性为75.11%,属于GSI-a类的GS蛋白。对ExiGS酶学性质研究发现,ExiGS的最适反应温度为35℃,最适pH为7.0。ExiGS具有良好的热稳定性,50℃水浴处理3h后,ExiGS仍保有90%左右的活性,60℃处理1h后,残余50%左右的活性。ExiGS对除草剂草铵膦也有较好的耐受性,含有exi GS基因的大肠杆菌能够在添加了50m M和100mM草铵膦的培养基中很好地生长,几乎不受草铵膦的影响。ExiGS在低温下也表现出较好的活性,在25℃时,ExiGS有约70%的活性,在5℃时仍有20%左右的活性。为了改善ExiGS的酶学性质,通过蛋白质多序列比对和分子模拟相结合,选择了与GS蛋白催化活性密切相关的位点进行定点突变。利用定点突变技术构建了8个单点突变体,其中E60A、R64G、E67A的活性都有提高,选取其中活性提高最显著的E60A、R64G进行深入研究,并将单点突变整合到一起研究其协同作用。突变体E60A的最适温度提高到45℃,突变体R64G的的最适温度提高到40℃,突变体E60A/R64G的最适温度提高到了50℃,然而突变体的最适pH并没有发生明显变化。突变体的热稳定性都得到了明显的提升,E60A和R64G在70℃处理3h后仍保有40%~50%左右的活性,突变体E60A/R64G在70℃处理了1.5h仍能残留有40%左右的活性,而野生型GS在70℃处理了1.5h后就几乎丧失了所有活性。突变体R64G热稳定性提高的同时,其低温活性也发生了变化,在0℃仍有36.19%的活性,在25℃时有81.94%的活性,与野生型GS相比低温活性有十分明显的提升。ExiGS对草铵膦竞争性抑制常数Ki为2.43±0.14mM,突变体R64G在活性提高的同时,对草铵膦的耐受性也表现出了提升,R64G对草铵膦的耐受性提高了1.02倍,其他突变体对草铵膦耐受性的提升不是特别明显。Glu60、Arg64等突变位点的选取是基于多序列比对、分子模拟和对酶催化机制的了解,实验结果也表明Glu60、Arg64对GS有重要的影响。通过进一步结构分析,其可能的主要原因是Glu60、Arg64位于GS酶类的催化调控区域Asp55 loop,E60A、R64G的变化提高了Asp55 loop的柔韧性,导致Asp55 loop在催化时更容易被“弹出”,从而促进了突变体的催化效率的提高。Asp55 loop柔韧性的改变也加强了GS关键催化区域间的氢键网络,使GS蛋白的稳定性加强。由于突变体活性的提高,其对草铵膦耐受性也有相应的增强。总之,改良后的ExiGS蛋白活性高,热稳定性好,耐低温和具有草铵膦耐受性等特点,这些极大地提升了了ExiGS在工业和转基因方面的应用价值,突变体E60A和R64G的获得为GS结构与功能关系研究提供了重要信息。