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目的:本专题以黄芩射干汤为研究对象,在文献研究和前期血清药物化学研究的基础上,筛选出黄芩射干汤有效成分群;利用分子对接技术,预测活性成分与相关靶点的作用方式及强弱,模拟黄芩射干汤可能的作用机制;建立大鼠感染后咳嗽模型,检测相关指标,从蛋白表达、体内生物标记物变化方面验证分子对接结果,探讨其作用机制;采用HPLC法,对黄芩射干汤筛选出的活性成分进行质量控制研究,上述研究将为黄芩射干汤临床应用奠定基础。材料与方法:1.通过查阅相关国内外文献以及TCMSP数据库,筛选了16个已报道的药理活性明确的黄酮类化合物,归纳总结了10个与气道炎症通路相关的蛋白结构,从PDB网站中查找蛋白-配体复合物晶体结构,采用Autodock 4.02对接软件对化合物与蛋白进行分子对接研究,通过相对分值（R=化合物的结合自由能/共结晶的结合自由能）评估各蛋白与化合物的作用强弱,选择作用较强的蛋白进行后续验证实验。2.根据分子对接的R值结论,进行动物体内验证实验。基于大鼠感染后咳嗽模型,采用HE染色法,观察模型动物肺组织气管、支气管、肺泡的形态,采用Western-blot方法检测动物肺组织中相关蛋白的表达水平,采用ELISA法检测大鼠血清、肺泡灌洗液细胞因子的水平。3.应用HPLC-VWD法,对黄芩射干汤中筛选的黄芩苷等8个活性成分进行含量测定研究,为黄芩射干汤的质量控制提供依据。结果:1.通过分子对接技术,利用相关数据库及分子对接软件,总结了黄芩射干汤所含16个黄酮类化合物的分子量、氢键给体、氢键受体及脂水分配系数,结果表明黄芩射干汤黄酮类化合物符合“Lipinski”类药性规则,表明黄芩射干汤黄酮具有良好的类药性。从分子对接能量相对分值结果来看,黄芩射干汤黄酮类成分与炎症代谢通路靶点中的COX-2及5-LOX的结合较好,R值均大于0.8,与P38 MAPK、PLA2、JNK 3及CYP4502C9亚型分子对接的相对分值也较好,R值均大于0.7,个别成分与JNK 1、LTA4H、CYP450 2C8及IKK-β分子对接的相对分值稍差,但都大于0.6;从化合物与蛋白的作用方式看,16个黄酮类成分均能与10个蛋白结合,表明黄芩射干汤所含黄酮类成分可能通过多成分、多途径、多靶点发挥抗气道炎症作用,其作用途径可能与AA代谢网络中COX-2及5-LOX关系密切。2.基于分子对接实验结果,选择LPS感染大鼠咳嗽动物模型作为药物初步作用模式研究的模型。动物模型组5 min内咳嗽次数显著增加,给予药物黄芩射干汤后能抑制模型大鼠5 min内咳嗽次数,减轻肺组织中支气管和周围炎症。采用Western-blot法检测模型动物大鼠肺组织中COX-2和5-LOX蛋白表达水平,结果表明:与正常对照组比较,模型组COX-2、5-LOX蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,说明所建立LPS感染大鼠咳嗽模型可激活花生四烯酸代谢通路中的COX-2和5-LOX,给予黄芩射干汤药物后,COX-2蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,而5-LOX蛋白表达无显著作用（P>0.05）,提示黄芩射干汤可能通过抑制花生四烯酸COX-2代谢途径从而发挥作用;采用ELISA法测定血清及肺泡灌洗液中花生四烯酸代谢产物PGE2及LTC4含量,结果表明:在COX代谢途径研究中,与正常组比较,模型血清及肺泡灌洗液中PGE2含量显著升高（P<0.05）,给予黄芩射干汤后含量下降（P<0.05）。结合蛋白印迹结果,推测黄芩射干汤可能是通过抑制COX-2表达,降低代谢产物PGE2的释放,从而减缓炎症反应。在LOX代谢途径研究中,实验结果表明,与正常组比较,模型组血清、肺泡灌洗液中LTC4含量显著升高（P<0.05）,说明所建立大鼠感染后咳嗽模型可激活AA代谢LOX途径,使得致炎性AA代谢产物LTC4大量生成。给予黄芩射干汤后LTC4含量有降低趋势,但是没有统计学意义。结合蛋白印迹结果,推测黄芩射干汤对LOX及其代谢产物的抑制作用不明显。3.应用HPLC-VWD法检测射干苷、鸢尾黄素、野鸢尾苷、次野鸢尾黄素、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及千层纸素A的含量。方法学验证实验表明分别在在0.056250.3375μg、0.0086560.05194μg、0.016130.09677μg、0.011340.06802μg、0.31461.888μg、0.11990.7194μg、0.056320.3379μg1及0.010350.06211μg的范围内,与峰面积线性关系较好,r值分别为0.9999、0.9999、1.000、1.000、1.000、1.000、0.9997及0.9998。结论:1.黄芩射干汤分子对接实验结果表明:黄芩射干汤中16个黄酮类成分与炎症通路十个靶蛋白中的COX-2及5-LOX的结合强度最好,其次是P38 MAPK、PLA2、JNK 3及CYP450 2C9,与JNK 1、LTA4H、CYP450 2C8及IKK-β结合稍差。推测黄芩射干汤发挥抗炎作用的途径可能与花生四烯酸炎症通路中的COX-2和5-LOX靶蛋白相关。2.验证实验选择LPS感染大鼠咳嗽模型,黄芩射干汤能明显抑制模型动物咳嗽次数,减轻肺组织炎症,抑制肺组织中COX-2表达,降低血清及肺泡灌洗液中细胞因子PGE2含量,表明黄芩射干汤通过干预花生四烯酸炎症通路中COX-2发挥抗气道炎症作用3.HPLC-VWD法测定射干苷、鸢尾黄素、野鸢尾苷、次野鸢尾黄素、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及千层纸素A含量的方法简便,灵敏度高,重复性好,可作为黄芩射干汤质量控制方法。