研究目的:宫内生长迟缓(Intrauterine Growth Restriction,IUGR),表现为胎儿未能达到其遗传因素影响下的应有大小,是胚胎发育异常最常见的形式。动物实验研究和流行病学调查都认为IUGR会增加成年期发生肥胖、冠心病、2型糖尿病和糖耐量异常等代谢综合征(Metabolic Syndrome,MS)的风险。然而迄今为止,IUGR引起代谢综合征的机制尚未阐明。近年来,表观遗传学的迅猛发展,各项试验手段的不断进步,为人们从表观遗传学角度探索IUGR引起成年期代谢综合征的机制提供了可能。DNA甲基化是表观遗传调控的重要方式之一,主要发生在CpG岛,能够对营养、发育、环境等不同的信号做出反应,参与完成细胞的时序调控和适应调控。DNA甲基化芯片技术和检测单个基因DNA甲基化的各种方法,为从整体基因组DNA甲基化和易感基因的DNA甲基化进行研究提供了技术平台。研究显示,IUGR新生儿表现为低血糖和低胰岛素血症,胰腺β细胞发育不良,功能障碍。胰腺β细胞的发育是一个由多因素共同参与的复杂过程,DNA甲基化是体内极为重要的基因内源修饰作用。本研究通过孕期全程低蛋白饮食法建立IUGR大鼠动物模型,观察IUGR大鼠不同时间点各项指标的变化规律,通过DNA甲基化芯片检测正常和IUGR新生鼠胰岛全基因组的DNA甲基化状态,筛选出差异性DNA甲基化位点,结合生物信息学分析结果最终确定候选位点。采用单个基因甲基化位点检测方法检测候选差异性DNA甲基化位点,并且检测其相对应基因mRNA水平的表达情况。本研究通过研究DNA甲基化在IUGR大鼠胰岛生长发育过程中的变化规律,旨在揭示DNA甲基化与IUGR的内在联系,为IUGR引发代谢综合征的机制研究提供新的线索。研究方法:运用孕期全程低蛋白饮食法建立IUGR大鼠动物模型,确认已受孕的SPF级健康Wistar雌鼠(体重230~280g)48只(中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供)。按照喂养饲料(中国医学科学院实验动物研究所提供)不同随机分成两组:标准饲料饮食组(n=24),蛋白含量23%,喂养至分娩得到正常子鼠,此为正常对照组(CON组);孕期全程低蛋白饮食(n=24),蛋白含量8%,喂养至分娩,取出生体重低于正常对照组子鼠平均体重2个标准差以下的为IUGR鼠,记为IUGR组。选择研究的时间点分别为D1、3W、12W和10M。选取雄鼠做为研究对象,每个时间点均选6只,分别来自6窝。采用外消化方法提取D1大鼠胰岛,内消化方法提取其他三个时间点的大鼠胰岛。采用双硫踪染色的方法鉴定胰岛。观察D1、3W、12W和10M各组大鼠的体重、胰腺重量、胰岛大小和数量、胰腺β细胞数量和体积变化情况,检测各时间点各组大鼠血糖和胰岛素水平。10M大鼠行正糖-高胰岛素钳夹实验以明确IUGR老年鼠是否存在胰岛素抵抗。MeDIP-chip筛选IUGR新生鼠启动子区差异性DNA甲基化位点:CON组和IUGR组D1大鼠胰岛各3例(分别来自3窝),采用DNeasy血和组织试剂盒(Qiagen,德国)提取纯化胰岛全基因组总DNA,超声碎裂成长度为~200-1000bp的片段DNA,以单克隆抗5’-甲基化胞嘧啶(5mC)抗体(Diagenode,比利时)做为抗体行免疫共沉淀,富集甲基化的片段DNA,全基因组扩增试剂盒(Sigma-Aldrich,USA)进行片段DNA的线性扩增,快速PCR纯化试剂盒(Qiagen,德国)纯化扩增后的DNA,NimbleGen双色DNA标记试剂盒(Roche,USA)以Cy3和Cy5标记片段DNA,最后与甲基化芯片NimbleGen Rat DNA Methylation3×720K Promoter Plus CpG Island Array(Roche)进行杂交反应。选用Nimble Scan v2.5分析软件对芯片的结果进行数据分析,对芯片发现的差异性DNA甲基化位点进行Gene Ontology分析和KEGG通路分析。胰腺发育相关基因数据库筛选候选DNA甲基化位点:2013-03-28在PubMed数据库中以“pancreas/growth and development”[mesh],限定specials:other animals为检索式。下载Medline格式的abstract(.txt)格式文献条目信息,将文献条目信息输入MetaMap,将其处理结果输入MetaMap数据处理软件(闫雷,中国医科大学医学信息系),对其结果进行筛查,建立共现矩阵,UCINET处理数据,最后得到胰腺发育相关基因数据库。将芯片发现的差异性DNA甲基化位点相对应的基因输入到胰腺发育相关基因数据库中,再次筛选最终得到候选的差异性DNA甲基化位点,再结合Gene Ontology分析和KEGG通路分析的分析结果,最终确定Pax6、Pde3b、Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1和Dnmt3a共6个位点做为候选DNA甲基化位点。首先,通过MeDIP-real time PCR方法检测这6个位点在IUGR和正常新生鼠胰岛启动子区DNA甲基化水平的变化情况用以验证芯片结果。接着,通过检测上述6个位点在10M时正常组和IUGR组大鼠胰岛启动子区DNA甲基化水平,以明确IUGR老年大鼠胰岛中这6个基因的DNA甲基化水平变化情况。采用real time PCR方法检测6个候选基因mRNA在D1和10M正常组和IUGR组大鼠胰岛的表达情况。最后,通过免疫荧光双染法和Western blot方法检测胰腺发育关键基因Nkx2.2和Nkx6.1在正常和IUGR新生鼠和10M大鼠胰腺的蛋白表达情况。结果:1.通过孕期全程低蛋白饮食法成功建立IUGR大鼠动物模型,新生鼠IUGR组体重明显低于CON组,IUGR组10M大鼠体重高于CON组(P<0.05)。IUGR组胰腺重量在D1、3W和12W这三个时间点均低于CON组(P<0.05)。10M时IUGR组胰腺重量高于CON组(P<0.05)。胰腺重量/体重比值IUGR组D1和12W明显低于CON组(P<0.05)。10M时胰腺重量/体重比值高于CON组(P<0.05)。子鼠胰岛大小,IUGR组D1和12W均低于CON组(P<0.05)。子鼠胰岛数量,IUGR组D1和12W均低于CON组(P<0.05)。IUGR大鼠胰腺β细胞分数和β细胞团体积在D1、12W和10M时IUGR组均低于CON组(P<0.05)。12W和10M时,IUGR大鼠空腹血糖较CON组偏高,血清胰岛素水平升高(P<0.05)。两组10M大鼠进行正糖-高胰岛素钳夹实验,结果发现60min和120 min时IUGR大鼠胰岛素分泌水平明显高于CON组(P<0.05)。IUGR组稳态葡萄糖输注率(SSGIR)显著低于CON组(P<0.05),表明IUGR老年大鼠发生外周组织胰岛素抵抗。2.通过MeDIP-chip对IUGR和正常新生鼠胰岛进行了高通量DNA甲基化水平的检测,筛选出254个启动子区差异性甲基化位点,其中,157个高甲基化位点(61.81%),97个低甲基化位点(38.19%)。在所有启动子区差异性甲基化位点中,HCP位居首位(102/254,40.12%),LCP居次位(90/254,35.43%)。373个差异性甲基化CpG岛包括110个低甲基化CpG岛(29.49%)和263个高甲基化CpG岛(70.51%)。在所有差异性甲基化CpG岛中,启动子区173个(46.38%),基因间165个(44.24%)。在所有差异性甲基化CpG岛中,227个有相对应基因(60.86%),146个尚无对应的基因(39.14%)。对254个启动子区DNA甲基化差异性位点所对应的基因进行Gene Ontology(GO)分析和KEGG通路分析。通过文本挖掘建立的胰腺发育相关基因数据库,包含220个胰腺发育相关基因。将DNA甲基化芯片筛选出的254个差异性DNA甲基化位点,输入到胰腺发育相关基因数据库,再次筛选,结合功能分析结果,最终确定Pax6、Pde3b、Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1和Dnmt3a共6个位点做为候选位点。3.通过MeDIP-real time PCR方法检测单个基因启动子区DNA甲基化水平,与正常组相比,在IUGR新生鼠胰岛中,Pde3b和Dnmt3a启动子区DNA高甲基化,Pax6启动子区DNA低甲基化,Pdx1、Nkx2.2和Nkx6.1启动子区DNA甲基化水平无变化。以上结果与DNA甲基化芯片结果一致。除Pax6 mRNA表达上调外,余5个基因mRNA表达水平均降低。这种变化同样发生在IUGR老年大鼠胰岛。Nkx2.2和Nkx6.1在IUGR新生鼠胰岛的表达下调,在IUGR老年鼠胰岛表达缺如。结论:1.宫内蛋白质营养不良导致大鼠IUGR发生率明显增高。IUGR大鼠胰岛发育受损,功能减退,随年龄增长至老年时出现代谢综合征。2.IUGR新生鼠胰岛发生整体水平DNA甲基化异常改变,胰腺发育关键基因启动子区DNA甲基化水平在新生鼠和老年鼠胰岛中发生异常改变,影响基因转录。表明宫内蛋白营养不良可能导致IUGR大鼠胰岛DNA甲基化异常改变,继而引起基因表达改变,影响胰腺发育和功能,最终导致代谢综合征。IUGR老年大鼠代谢综合征是生命早期的环境因素印迹的“程序化”结果。