第一部分验证KGN促进肌腱干细胞成软骨分化的能力目的:体外实验验证KGN促进肌腱干细胞向软骨分化的能力,检验体内应用KGN促进腱骨愈合研究的可行性,为随后实验提供理论基础。方法:采用胶原酶和中性酶消化法获取原代肌腱干细胞进行培养,采用单细胞培养法提纯肌腱干细胞。然后通过免疫荧光和流式细胞术检测细胞表面标志物以鉴定所提取细胞是否是肌腱干细胞。然采用不同浓度的KGN处理肌腱干细胞;使用CCK-8方法检测KGN对于肌腱干细胞的促增殖效应;使用逆转录聚合酶链式反应方法检测KGN对于肌腱干细胞的促分化效应。结果:采用胶原酶和中性酶消化法以及单细胞培养技术,并经过免疫荧光和流式细胞术鉴定结果表明以上方法可以获取纯度较高的原代肌腱干细胞。通过CCK-8方法检测的增殖实验结果表明不同KGN浓度(1n M,10n M,100n M,1μM,10μM)的实验组中细胞增殖速度并未见明显差异,并且与空白对照组无明显差异,这表明KGN对肌腱干细胞的促增殖能力不明显。通过逆转录聚合酶链式反应方法检测不同浓度KGN处理后肌腱干细胞中软骨分化相关的三个标志物(Col-2,Sox-9和Aggrecan)均有不同程度的升高,而且升高程度与KGN浓度正相关,这也表明KGN促进肌腱干细胞成软骨分化能力突出。结论:我们采用的肌腱干细胞提取和鉴定方法较为成熟,可以获取纯度较高的肌腱干细胞。KGN无明显促进肌腱干细胞增殖的能力,但KGN诱导肌腱干细胞成软骨分化作用明显。通过对于KGN的体外实验研究和验证结果表明KGN对于肌腱干细胞的作用符合我们预期,适合应用于腱骨愈合的体内实验研究,因而可将KGN用于下一步的体内实验。第二部分L-PRP与P-PRP对肌腱干细胞的不同细胞学作用目的:以肌腱干细胞作为细胞研究对象,研究两种不同的富血小板血浆血浆(P-PRP(纯富血小板血浆)和L-PRP(富含白细胞血小板血浆))对肌腱干细胞的合成,分解代谢水平以及炎症反应的同作用,最终获得L-PRP与P-PRP的不同细胞学作用,并选出其中更有利于组织修复的一种PRP用于随后的动物实验;联合KGN并作为其载体应用于腱骨愈合的实验研究中。方法:使用高速短时间的二次离心法获取P-PRP和L-PRP,将获得的两种PRP调整至相同的血小板浓度。采用与第一部分相同的方法制取和鉴定肌腱干细胞。使用Transwell系统对肌腱干细胞进行体外培养,细胞置于下层,P-PRP或L-PRP放入上层。使用CCK-8进行细胞增殖实验检测L-PRP和P-PRP在2%,5%,10%和20%四种不同浓度下对肌腱干细胞的增殖作用。另一部分细胞连续培养14天,通过光镜不断监测细胞形态,并收集细胞培养液上清和细胞通过RT-PCR、Western Blot、细胞免疫荧光染色以及ELISA等手段检测不同处理后细胞的合成代谢、分解代谢以及炎症状态。结果:我们采用的PRP制取方法可以稳定的获取3倍浓度的P-PRP和L-PRP。细胞增殖实验结果表明P-PRP和L-PRP均可明显促进肌腱干细胞增殖,并且与剂量相关,在10%的浓度时促增殖效果最佳,而浓度若继续升高促增殖能力逐渐下降。两种PRP均可诱导肌腱干细胞成肌腱细胞分化并能激活肌腱细胞。但是两种PRP在很多效果上还存在差异。L-PRP可促进肌腱干细胞处于更高的分解代谢和炎症状态;它的作用可以提高分解代谢相关因子MMP-1和MMP-13以及炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α和PGE2的表达。想法P-PRP这主要提高合成代谢相关因子的表达比如COL-1,COL-3以及α-SMA。结论:这些结果表明L-PRP与P-PRP的细胞学作用的确存在差异。因此PRP类型的不同(特别是是否富含白细胞)很可能是影响PRP疗效导致临床结果不一致的关键因素。由于腱骨愈合的关键是促进纤维软骨组织的修复和再生,因此我们选择促进组织愈合再生方面能力更优的P-PRP作为KGN的载体,应用于随后的动物实验中,检测KGN联合P-PRP促进腱骨愈合的效果。第三部分KGN联合P-PRP促进腱骨愈合和纤维软骨再生的体内实验研究目的:探讨KGN联合P-PRP胶对纤维软骨再生以及腱骨连接愈合的作用。方法:按照第二部分方法制取P-PRP,再与KGN粉末按照预先设计的浓度进行混合。采用HPLC(高效液相色谱法)检测KGN在P-PRP胶中的释放情况。建立大鼠腱骨隧道愈合模型。体内实验总共51只大鼠,随机分为三组进行处理:组1向骨隧道中同时注射KGN+PRP混合液50μl+牛凝血酶5μl;组2向骨隧道中注射PRP混合液50μl+牛凝血酶5μl;组3向骨隧道中注射生理盐水50μl+牛凝血酶5μl。同时组2与组3的溶液中含有与组1溶液中相同浓度的二甲亚砜。于术后第4周,8周,12周取组织标本进行组织学检测(H&E,Safranin O+Fastgreen,IHC,IF),每次每组3只。于第8周获取标本进行生物力学检测,每组8只。结果:KGN在PRP胶中的释放实验表明KGN释放可持续4天,在最开始的4小时释放速度最快,4-48小时释放速度逐渐下降直至平台期。H&E和Safranin O+Fastgreen染色结果表明KGN联合PRP胶可以明显促进腱骨连接处的软骨生成,免疫染色结果显示再生的软骨高表达Col-1和Col-2,说明再生软骨为纤维软骨。生物力学实验结果也表明KGN联合PRP胶组可以明显提升腱骨连接处的机械性能。并且我们还发现单独应用PRP胶并不能有效的促进腱骨界面的软骨再生。结论:KGN联合PRP凝胶可诱导腱骨连接界面的纤维软骨再生进而促进腱骨隧道愈合;单独施加PRP处理则未见此疗效。本研究结果表明在腱骨界面应用KGN可能会成为未来临床应用中一种很有前景的非细胞治疗手段促进腱骨愈合。