论文部分内容阅读
牛流行热（Bovine Ephemeral Fever,BEF）是由牛流行热病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus,BEFV）感染牛引起的一种急性、热性传染病。该病可导致产奶量下降和死亡率上升,给我国养牛业造成重大经济损失。尽管已经生产了许多预防BEFV感染的商业疫苗,但目前的预防和控制策略不能对感染BEFV的牛提供可持续的保护。近年来,宿主因子与病毒的相互作用机制越来越受到人们的关注。因此深入研究BEFV复制的分子机制,开展病毒与宿主因子互作的研究将有助于我们更好地了解病毒感染的机制。BEFV基因组共编码5个结构蛋白（N、P、M、G、L）和6个非结构蛋白(GNS、α1、α2、α3、β、γ)。研究表明,病毒蛋白在病毒复制中发挥至关重要的作用,但目前BEFV非结构蛋白的功能在很大程度上是未知的。因此,通过对BEFV非结构蛋白的功能进行研究,为深入探讨BEFV复制的分子机制奠定基础。hnRNP K为hnRNPs家族成员,可以与RNA、DNA、蛋白质结合,参与RNA剪切加工、转录、翻译调控、细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程。目前研究表明,hnRNP K影响了多种病毒的复制。然而,BEFV与宿主因子hnRNP K的相互作用尚未见报道。本研究开展了宿主基因hnRNP K、病毒蛋白α3、细胞凋亡的相互作用关系研究,取得主要研究进展如下:通过基因的过表达和沉默技术,发现hnRNP K基因抑制BEFV复制。首先分别构建了hnRNP K的shRNA沉默表达载体和hnRNP K沉默表达细胞系,BEFV感染后,通过检测病毒滴度,发现沉默hnRNP K可以促进BEFV复制。同时,构建hnRNP K慢病毒过表达载体和hnRNP K过表达细胞系,BEFV感染后,发现过表达hnRNP K可以抑制BEFV复制。免疫共沉淀结果表明hnRNP K与病毒蛋白α3互作,过表达hnRNP K抑制α3的表达不依赖于蛋白酶体、自噬溶酶体以及caspase途径。通过蛋白质免疫共沉淀验证了hnRNP K和α3存在相互作用;将α3真核表达载体分别与hnRNP K真核表达载体和对照载体共转染BHK-21细胞,检测到过表达hnRNP K抑制了病毒蛋白α3的表达;用MG132、CQ、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK处理后,α3的表达水平并没有发生回调,表明hnRNP K抑制病毒蛋白α3的表达不依赖于蛋白酶体、自噬溶酶体以及caspase途径。BEFV非结构蛋白α3诱导细胞凋亡,细胞凋亡促进BEFV复制,hnRNP K抑制BEFV诱导的细胞凋亡。过表达α3基因,Cleaved caspase 3和Cleaved PARP表达明显上调,表明BEFV非结构蛋白α3诱导细胞凋亡;分别用细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和细胞凋亡诱导剂CCCP预处理BHK-21细胞,DMSO组作为对照,0.1MOI的BEFV分别感染处理组和对照组细胞24 h,TCID50检测,结果表明细胞凋亡促进病毒复制;BEFV感染hnRNP K过表达细胞系,Cleaved caspase3和Cleaved PARP表达与对照组相比均明显下调,表明过表达hnRNP K抑制BEFV诱导的细胞凋亡。BEFV感染下调hnRNP K蛋白水平的表达,hnRNP K的降解不通过蛋白酶体和自噬溶酶体途径,主要由caspase 3活性介导。通过对BEFV感染BHK-21细胞不同时间点的细胞样品分别进行RT-qPCR和western blot检测,发现BEFV感染BHK-21细胞后,hnRNP K mRNA水平上调,蛋白水平下调。MG132、CQ处理细胞,hnRNP K蛋白水平并没有发生回调,表明BEFV下调hnRNP K蛋白水平表达不通过泛素蛋白酶体和自噬溶酶体途径;用caspase 3抑制剂Z-DEVD-FMK预处理BHK-21细胞4 h,感染BEFV,发现hnRNP K蛋白表达回调,结果表明hnRNP K的蛋白降解是由caspase 3活性介导的。综上所述,本研究通过对宿主基因hnRNP K、病毒蛋白α3、细胞凋亡的相互作用关系进行探讨,发现了BEFV感染下调hnRNP K蛋白水平表达,hnRNP K抑制病毒复制;病毒蛋白α3诱导细胞凋亡以及细胞凋亡促进BEFV复制;率先揭示了hnRNP K通过抑制α3的表达以及BEFV诱导的细胞凋亡抑制病毒复制;hnRNP K蛋白水平表达的下调是由caspase 3活性介导的分子机制。为抗病毒药物的研发提供理论依据。