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反胶束萃取具有使用条件温和,萃取效率高,成本低,溶剂可重复利用,不引起蛋白质和酶变性等许多优点,用于分离和纯化蛋白质等生物大分子具有巨大的应用前景。本论文运用该技术进行了从粗胰酶中分离纯化胰蛋白酶的研究,对反胶束中胰蛋白酶STM图像进行了探讨,验证了在AOT反胶束中用胰凝乳蛋白酶催化合成乙酰氨基苯丙酰基-丁膦酸酰胺的反应。观察AOT/异辛烷反胶束中胰蛋白酶的STM形貌,发现该酶的构象发生了变化,卷曲程度增加,空间结构更紧密,相对于水中“刚性”增强,处于“部分活化”状态。由于处于“相对刚性”结构,其π-π共轭程度减弱,反胶束中紫外光谱、荧光光谱相对于水中均发生了蓝移。用生物纯胰蛋白酶进行的反胶束萃取初步试验结果指出:① 胰蛋白酶萃取率与pH值关系经非线性方程拟合为型,对0.1mol/L AOT/异辛烷,,;对0.05mol/L AOT/异辛烷,,;对0.01mol/L AOT/异辛烷,,。② 在5.2>pH>4.8区间,由于大量H+竞争AOT的极性头部,随着pH降低萃取率降低;在10>pH>5.3区间,萃取率随pH值降低而增加,因为pI-pH差越大,萃取蛋白的推动力越大。增大表面活性剂浓度,可以适当减小pH对萃取率的影响,但酶失活增加。③ 试验表明:用AOT/异辛烷反胶束萃取生物纯胰蛋白酶,其AOT最佳浓度为0.05mol/L,萃取最适pH为5.2～5.3,反萃取最适pH为9.9～10。④ 各种离子对萃取率影响大小是:Ca2+<Na+<K+;增大相同离子的离子强度,反胶束内表面的双电层变薄,减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引,萃取率减小。⑤试验表明:最佳萃取离子强度为0.1mol/L CaCl2;最佳反萃取离子强度为1mol/L KCl。用AOT/异辛烷反胶束进行了粗胰酶中胰蛋白酶的分离纯化,系统研究了各种因素对胰蛋白酶萃取率和比活力的影响。① 萃取及反萃取时间均对胰蛋白酶活力有影响,最佳萃取与反萃取时间均为5min。② 正交试验结果表明:本体相浓度、萃取与反萃取相比也影响胰蛋白酶活力,最佳纯化条件是本体相浓度为1mg/mL,萃取与反萃取相比均为1:1。③ 在此条件下,总萃取率22.7%,胰蛋白酶纯化倍数为3.6,胰蛋白酶比活力达到78.9BAEE U/mg,比活力纯化倍数为3.1,失活率13.9%。④ 将回收的反胶束再次用于萃取试验,胰蛋白酶总萃取率达到19.8%,比活力纯化倍数为2.8。⑤对AOT/Span-40混合反胶束试验结果表明,总萃取率为16.5%,胰蛋白酶比活力纯化倍数为2.9,分别比AOT/异辛烷反胶束体系低6.2%和6.5%。 <WP=5>反胶束酶系统能同时增溶亲水性底物和疏水性底物,而且蛋白水解酶在反胶束中具有催化合成酰胺键的特性。本文验证了在0.1mol/L AOT反胶束中,40℃,pH值9.40条件下,α-胰凝乳蛋白酶催化α-N-乙酰苯丙氨酸乙酯与α-氨基丁膦酸合成含膦二肽的反应。实验结果表明:通过检测游离氨基与邻苯二甲醛反应产生的荧光,得到反应30min、60min后游离氨基比反应前显著降低,因而证实乙酰氨基苯丙酰基-丁膦酸酰胺被合成。