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[研究背景]很多miRNA在基因组中以簇的形式存在,序列相似、转录方向一致且协同发挥作用。miR-183、miR-96和miR-182共同构成miR-183/96/182簇。miR-183/96/182簇的成员位于人类染色体7q32.2,相距4413bp内且转录方向相同。这些miRNA转录于基因间区且有独立的启动子。这些miRNA的协同表达可能在人类生命活动的正常生理或病理条件下(包括肿瘤)发挥着重要的作用。人类miR-183/96/182簇在多种肿瘤中高表达,且这种过表达对于膀胱癌、前列腺癌和尿细胞学搜检来说是一种很好的标志物。miR-183/96/182簇的多效性体现在可调节髓母细胞瘤的细胞存活、增殖和迁移。然而,miR-183/96/182簇的协同表达在胶质瘤的发生和发展中的作用机制尚不清楚。[miR-183/96/182簇调控胶质瘤细胞的增殖与凋亡]原位杂交及qRT-PCR均证实miR-183、miR-96和miR-182在脑胶质瘤中高表达。在U251、U87细胞中转染miR-183/96/182簇中的单个或全部miRNA mimics48h后进行MTT分析,结果发现过表达miR-183/96/182簇可以促进胶质瘤细胞的增殖。而沉默miR-183/96/182簇中的单个或全部miRNA48h后进行Hoechst染色检测凋亡,结果发现miR-183/96/182簇沉默促进胶质瘤细胞的凋亡。因此,miR-183/96/182簇表达增加时促进细胞增殖,而表达降低时促进细胞凋亡。很多凋亡刺激因子导致的早期线粒体激活的特征,主要表现为呼吸相关蛋白的快速诱导及其迅速输入线粒体参与线粒体呼吸、导致线粒体膜超极化和耗氧量增加。因此,我们用JC-1检测了U251细胞中miR-183/96/182簇对线粒体膜电位(MMP,△Ψm)的影响。结果显示：在对照细胞组,线粒体膜电位高,JC-1表现为显著的红色荧光;miR-183/96/182簇沉默可以降低MMP,即绿色荧光增加;全部沉默组绿色荧光的强度最强,在单个沉默组中,miR-96沉默对于细胞的MMP影响最为明显。[FGF9、CPEB1和FOXO1是miR-183/96/182簇的靶基因]已有文献证实FOXO1是miR-183/96/182簇的靶基因。应用在线软件预测发现,FGF9、CPEB1亦是成熟miR-183、miR-96和miR-182的靶基因,荧光素酶分析实验证实了miR-183、miR-96和miR-182可分别与FGF9或CPEB1的3’-UTR区结合。U251细胞转染miR-183/96/182簇中单个或全部miRNA mimics48h后抽取RNA及蛋白进行qRT-PCR及Western Blot分析,结果发现过表达miR-183/96/182簇能降低其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1mRNA和蛋白的表达,而沉默miR-183/96/182簇后FGF9、CPEB1和FOXO1mRNA和蛋白的表达均升高。[miR-183/96/182簇通过靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1对胶质瘤细胞内ROS生成的影响]在U251、U87细胞中过表达或沉默miR-183/96/182簇48h后,用荧光分光光度仪分析H2DCFDA (2’,7’-dichlorodihydrofulorescein diacetate,2’,7’二氯双氢荧光素二乙酸酯)染色的细胞数检测细胞中ROS的含量。结果发现过表达miR-183／96/182簇后胞内ROS的表达降低,而沉默miR-183/96/182簇后胞内ROS的表达增加。用NAC(ROS的抑制剂)处理miR-183/96/182簇沉默细胞组后,用同样的方法分析细胞中ROS的含量,结果发现细胞中ROS的含量降低。因此,过表达miR-183/96/182簇可以抑制ROS的生成,沉默miR-183/96/182簇可以促进ROS的产生,然而ROS抑制剂NAC可以阻断miR-183/96/182簇沉默对ROS生成的促进作用。与miR-183、 miR-96和miR-182mimics的结果一致,干扰FGF9、CPEB1或FOXO1可以降低ROS的生成且阻断miR-183/96/182簇沉默对ROS生成的促进作用。[miR-183/96/182簇对AKT/P53凋亡信号通路的影响]AKT和P53信号通路是由ROS激活的两个最重要的信号转导途径。线粒体依赖的细胞凋亡途径的活化可以通过AKT途径激活ROS信号,而P53可以介导ROS诱导的抗增殖活性和早期衰老或凋亡。为了研究miR-183/96/182簇对AKT/P53/凋亡信号通路的影响,我们用Western Blot检测了不同处理U87细胞中线粒体相关凋亡分子的表达情况。结果发现：miR-183/96/182簇过表达时,p-AKT表达增加、P53表达降低、Bax表达降低、Bcl-2表达增加、Caspase9和细胞色素C均胞质表达降低线粒体表达增加,抑制细胞凋亡；miR-183/96/182簇沉默时则与之相反。干扰FGF9、CPEB1和FOXO1后,p-AKT表达降低,与miR-183/96/182簇过表达时的结果不一致；而P53的表达降低与miR-183/96/182簇过表达时结果一致。这表明miR-183/96/182簇介导AKT磷酸化的过程不依赖其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1,而其介导P53表达降低则依赖其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1。因此,miR-183/96/182簇沉默诱导的ROS介导的AKT/凋亡途径不依赖其靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1,而该簇沉默诱导的ROS介导的P53/凋亡途径依赖其上述三个靶基因。[miR-183/96/182簇沉默可增加胶质瘤对化疗的敏感性]为了研究miR-183/96/182簇沉默是否可以影响TMZ的药理抑制作用,我们评估了不同处理U87细胞的抗癌效果。结果发现：TMZ可以促进胶质瘤细胞内ROS的生成,且相较于未沉默处理组,miR-183/96/182簇沉默处理组细胞内ROS生成更为显著；TMZ可以促进胶质瘤细胞的凋亡,且相较于未沉默处理组,miR-183/96/182簇沉默处理组细胞的凋亡更为显著。因此,miR-183/96/182簇沉默可以增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。综上所述,miR-183/96/182簇的表达或沉默协同参与了胶质瘤细胞中ROS介导的氧化细胞凋亡；miR-183/96/182簇沉默可增加胶质瘤对化疗的敏感性。