胆碱能神经元是中枢神经系统中一类重要的调制类神经元,分布于脑内多个关键脑区,支配学习、认知、睡眠、恐惧等功能。胆碱能神经元的异常会引起多种神经系统疾病。前期研究显示,基底前脑的胆碱能神经元通过复杂的投射参与不同的功能环路,与运动核团等胆碱能神经元存在明显差异,而其基因层次的机制尚不清晰。单细胞测序是在单细胞或单类细胞群体的层次对遗传信息进行分析,能够从转录水平解析细胞形态和功能的多样性。本文利用单细胞测序技术获取了基底前脑胆碱能神经元的转录组信息,并与中脑及脑干的胆碱能神经元进行对比,初步解析了其形态和功能差异的基因机制。本研究使用Chat-ires-Cre×Ai47转基因小鼠,使得乙酰胆碱能神经元特异性表达绿色荧光蛋白。利用免疫荧光验证了细胞特异性,并确定了基底前脑等目标脑区。通过对切片制备参数、孵育温度、氧饱和度以及消化过程中吹打力度等参数进行调整,优化了细胞悬液的制备方法,提高了神经元的活性,最终保持细胞存活率在80%左右。对目标脑区的荧光细胞进行消化分离,采用Smart-seq2方案构建c DNA文库,利用Illumina平台进行了测序。结果显示数据比对到基因库的效率高达95%,每个样本平均检测到19157个基因。通过GO功能富集和KEGG通路分析发现基底前脑斜角带与其他脑区相比差异基因集中在轴突和树突的形成、神经元的突触连接及神经环路的构建,并且发现了Lhx2、Lhx6、Lhx8、Six3、Vax1等基因参与了胆碱能神经元的形态发生和神经环路构建。进而,与外侧被盖核的胆碱能神经元转录组数据对比分析,发现Robo3、Robo4、Mybpc1、Ptprd、Kndc1等基因存在明显差异,这些基因与神经元的形态和神经环路形成相关;与舌下核的胆碱能神经元对比发现Mbp、Mobp、Cnp、Prkacb、Syt11等基因有明显差异,这些基因参与神经元形态和轴突引导的过程。上述结果提示基底前脑神经元的复杂形态结构与特定基因的表达差异相关。本研究为基底前脑、运动核团和中脑的胆碱能神经元的形态发生和功能分析提供了新的数据,为胆碱能神经元的异质性表达提供基因数据的支持,有助于从转录水平了解不同脑区同类型神经元的分化调控机制。