【摘 要】
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链格孢属(Alternaria spp.)是半知菌真菌,广泛分布在自然界的各种基质中,包括腐生菌,内生菌和致病菌三种,该属中有95%以上的菌种类兼性寄生在植物上并引起多种病害。链格孢属虽是无性真菌,以无性存在的同时,也可以有性繁殖,产生新的链格孢霉菌和新的代谢产物,目前,已有70多种代谢物被证实有明显的毒性,如细胞毒性、急性毒性、胚胎毒性和三致效应等。在一定的环境条件下,此类代谢产物可能会积聚在果
【基金项目】
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山东省自然科学基金项目(NO.ZR2017LC022)“链格孢霉毒素在樱桃采后贮藏和保鲜中的隐蔽形式研究”
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链格孢属(Alternaria spp.)是半知菌真菌,广泛分布在自然界的各种基质中,包括腐生菌,内生菌和致病菌三种,该属中有95%以上的菌种类兼性寄生在植物上并引起多种病害。链格孢属虽是无性真菌,以无性存在的同时,也可以有性繁殖,产生新的链格孢霉菌和新的代谢产物,目前,已有70多种代谢物被证实有明显的毒性,如细胞毒性、急性毒性、胚胎毒性和三致效应等。在一定的环境条件下,此类代谢产物可能会积聚在果蔬及制品和农产品中,后流入市场,威胁人类健康。目前针对真菌毒素的研究都是以游离态毒素为主,而对毒素的结合隐蔽型的报道相对较少。因此,本论文利用借助多种可视化数据分析软件与方法,对链格孢霉菌的游离态和结合态毒素进行代谢通路分析研究。本论文选取5株梨黑斑病病原菌和2株樱桃内生菌作为供试菌株,分别接种至自制的马铃薯胡萝卜琼脂培养基和马铃薯蔗糖琼脂培养基,以及商用马铃薯葡萄糖琼脂培养基三种不同基质的培养基中进行培养,采用UPLC-MS/MS法对其进行代谢产物分析。通过与商用毒素标准品以及实验室前期研究结果比对鉴定,确证了9种游离态毒素:alternariol(AOH),alternariol monomethyl ether(AME),altenuene(ALT),altenusin(ALU),tentoxin(TEN),tenuazonic acid(Te A),altertoxin-I(ATX-I),dehydroaltenusin(DHA)和desmethyldehydroaltenusin(DMDA);4种硫酸盐结合态毒素:AOH-Sulfated,AME-Sulfated,DHA-Sulfated和DMDA-Sulfated。以高分辨质谱(HRMS)的响应值作为定量标准制作热图,对不同菌株在不同培养基中不同培养时间下进行毒素含量分析,结果显示在PSA培养基上产生链格孢霉毒素量最多,PCA培养基中毒素产量最少。通过建立OPLS-DA模型分析表明,梨黑斑病病原菌和樱桃内生菌两种不同组间存在明显的代谢产物差异。利用MZmine 2和Global Natural Products Social Molecular Networking(GNPS)分析工具对三种培养基中的链格孢霉毒素进行代谢通路分析。借助元数据文件对分子网络进行分析,共发现6个链格孢霉毒素代谢簇,在PSA培养基中培养的霉菌有相对完整的代谢通路途径。本试验后续以莱阳梨为研究材料,将7株链格孢霉菌株复苏至PSA培养基培养并制备菌丝块接种至莱阳梨果实上,接种样品分别置于4℃和25℃下贮藏,模拟不同温度环境下菌株对莱阳梨的侵染过程,探究链格孢霉毒素在莱阳梨果实内的代谢通路和污染程度。实验结果表明,被侵染的莱阳梨果实在4℃和25℃下均有链格孢霉毒素被检出,鉴定为AOH,AME,ALT,ALU,TEN,Te A和ATX-I 7种游离态毒素以及AME-Glucosed,ALU-Glucosed和Te A-Glucosed 3种葡萄糖结合隐蔽型毒素,其中Te A的含量最高,为358.099mg/kg。通过FBMN对确证的游离态和隐蔽型毒素建立分子网络,通过与GNPS平台的光谱数据库进行比对,在数据库中共匹配到268种化合物。分子网络显示AOH,AME,ALT,ALU,TEN,Te A和Te A-G均有代谢通路,而ATX-I,AME和ALU的葡萄糖隐蔽型毒素在代谢通路图中孤立存在,是由于节点光谱数量较少,导致与光谱数据库中的无法共识别导致。研究发现,122号菌株在培养基中不产生ALU,但在25℃下被侵染的莱阳梨组织4次提取样中均有检出,是由于菌株在侵染植物时产生毒素的过程中,由寄主产生的信号分子或次生代谢产物能起到促进或抑制真菌毒株产毒的作用,导致菌株在人工培养基和植物体内的产毒种类存在一定的差异性。
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