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目的：
脂肪来源干细胞（Adipose Derived Stem Cells，ADSCs）能通过旁分泌、炎症调节和再分化等机制促进移植脂肪的存活，在细胞辅助脂肪移植术（cell-assisted lipotransfer，CAL）中起着重要作用。脂肪移植术后早期移植物周边处于缺血缺氧环境，如何提高人脂肪源干细胞(hADSCs)对低养分的耐受力十分重要。以往研究表明乙酰左旋肉碱(Acetyl-L-Carnitine，ALC)可以缓解多种应激引发的细胞损伤，减少ADSCs的衰老并改善其干细胞性。采用无血清培养饥饿ADSCs并予ALC加以干预，以研究ALC对体外饥饿状态下ADSCs活性的影响，并探索相关机制。
方法：
1、ADSCs的获取与鉴定
（1）从人脂肪抽吸物中获取ADSCs，5％CO2、37℃下传代培养至第5代开始实验。
（2）成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定ADSCs。
2、ADSCs的处理
（1）用无血清培养基分别饥饿细胞0,2,4,8,16,24小时，CCK-8实验确定合适饥饿时间。
（2）用含0，0.01，0.1，1，10，100mM浓度ALC的完全培养基培养ADSCs，CCK-8实验初步划定ALC的使用范围。
（3）用完全培养基或含0，0.1，0.5，1，5，10mM浓度ALC的无血清培养基饥饿培养ADSCs8小时，CCK-8实验和台酚蓝染色确定ALC的使用浓度。
3、ADSCs活性测试，包括增殖能力和迁移能力
（1）用无血清培养基饥饿处理ADSCs8小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC，同上述方法行CCK-8和台酚蓝检测。
（2）TUNEL法联合荧光显微镜及流式细胞仪检测ADSCs的凋亡情况。
（3）衰老相关β-半乳糖苷酶检测ADSCs的衰老情况。
（4）WB检测ADSCs内干细胞基因（OCT4、NANOG、SOX2）表达情况。
（5）行划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力的改变。
4、ADSCs内ROS检测
（1）无血清培养基饥饿处理ADSCs8小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC。
（2）DCFH-da试剂盒检测细胞内ROS含量。
（3）WB检测细胞内抗氧化物歧化酶（SOD1）的表达。
5、ADSCs细胞内自噬和凋亡平衡及其机制的探究
（1）无血清培养基饥饿处理ADSCs8小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC。WB检测细胞内JNK1、p-JNK1、Bcl2、Bax、caspase-3、LC3bⅡ/Ⅰ、P62和Beclin1的表达情况。
（2）无血清培养基饥饿处理ADSCs0,2,4,8,16,24小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC。Co-IP联合WB检测分析细胞内Bcl2/Bax复合体和Bcl2/Beclin1复合体的解离情况。
结果：
1、提取细胞能成功贴壁和被成脂、成骨和成软骨诱导，证明提取ADSCs成功。
2、无血清培养基饥饿处理ADSCs8h时细胞增殖活性和迁移能力明显减低，凋亡和衰老的程度增加，同时干细胞基因（OCT4、NANOG）的表达减低。同期添加1mM浓度的ALC处理则能明显改善上述情况。
3、饥饿8h时ADSCs内ROS产量明显上升。同时予1mM的ALC处理能显著减少ROS产量，上调细胞SOD1的表达。
4、WB检测发现8小时饥饿显著下调了Bcl2/Bax比值，增加caspase-3的表达，伴随着p-JNK1/JNK1比值的上调；加入1mM浓度的ALC时上述指标均被改善。同时8小时饥饿下调LC3bⅡ/Ⅰ比值和Beclin1的表达，增加P62的表达；1mM浓度的ALC处理逆转了上述改变。
5、1mM浓度的ALC处理将饥饿ADSCs内Bcl2/Bax复合体的解离时间点由8h推迟到16h，并促进了2h时Beclin1/Bcl2复合体的解离。
结论：
8小时饥饿处理抑制了ADSCs的增殖和迁移能力，1mM浓度的ALC则能予以改善，这可能涉及到对细胞内氧化还原状态和自噬-凋亡平衡的调节。
脂肪来源干细胞（Adipose Derived Stem Cells，ADSCs）能通过旁分泌、炎症调节和再分化等机制促进移植脂肪的存活，在细胞辅助脂肪移植术（cell-assisted lipotransfer，CAL）中起着重要作用。脂肪移植术后早期移植物周边处于缺血缺氧环境，如何提高人脂肪源干细胞(hADSCs)对低养分的耐受力十分重要。以往研究表明乙酰左旋肉碱(Acetyl-L-Carnitine，ALC)可以缓解多种应激引发的细胞损伤，减少ADSCs的衰老并改善其干细胞性。采用无血清培养饥饿ADSCs并予ALC加以干预，以研究ALC对体外饥饿状态下ADSCs活性的影响，并探索相关机制。
方法：
1、ADSCs的获取与鉴定
（1）从人脂肪抽吸物中获取ADSCs，5％CO2、37℃下传代培养至第5代开始实验。
（2）成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定ADSCs。
2、ADSCs的处理
（1）用无血清培养基分别饥饿细胞0,2,4,8,16,24小时，CCK-8实验确定合适饥饿时间。
（2）用含0，0.01，0.1，1，10，100mM浓度ALC的完全培养基培养ADSCs，CCK-8实验初步划定ALC的使用范围。
（3）用完全培养基或含0，0.1，0.5，1，5，10mM浓度ALC的无血清培养基饥饿培养ADSCs8小时，CCK-8实验和台酚蓝染色确定ALC的使用浓度。
3、ADSCs活性测试，包括增殖能力和迁移能力
（1）用无血清培养基饥饿处理ADSCs8小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC，同上述方法行CCK-8和台酚蓝检测。
（2）TUNEL法联合荧光显微镜及流式细胞仪检测ADSCs的凋亡情况。
（3）衰老相关β-半乳糖苷酶检测ADSCs的衰老情况。
（4）WB检测ADSCs内干细胞基因（OCT4、NANOG、SOX2）表达情况。
（5）行划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力的改变。
4、ADSCs内ROS检测
（1）无血清培养基饥饿处理ADSCs8小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC。
（2）DCFH-da试剂盒检测细胞内ROS含量。
（3）WB检测细胞内抗氧化物歧化酶（SOD1）的表达。
5、ADSCs细胞内自噬和凋亡平衡及其机制的探究
（1）无血清培养基饥饿处理ADSCs8小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC。WB检测细胞内JNK1、p-JNK1、Bcl2、Bax、caspase-3、LC3bⅡ/Ⅰ、P62和Beclin1的表达情况。
（2）无血清培养基饥饿处理ADSCs0,2,4,8,16,24小时，同期添加或不添加1mM浓度的ALC。Co-IP联合WB检测分析细胞内Bcl2/Bax复合体和Bcl2/Beclin1复合体的解离情况。
结果：
1、提取细胞能成功贴壁和被成脂、成骨和成软骨诱导，证明提取ADSCs成功。
2、无血清培养基饥饿处理ADSCs8h时细胞增殖活性和迁移能力明显减低，凋亡和衰老的程度增加，同时干细胞基因（OCT4、NANOG）的表达减低。同期添加1mM浓度的ALC处理则能明显改善上述情况。
3、饥饿8h时ADSCs内ROS产量明显上升。同时予1mM的ALC处理能显著减少ROS产量，上调细胞SOD1的表达。
4、WB检测发现8小时饥饿显著下调了Bcl2/Bax比值，增加caspase-3的表达，伴随着p-JNK1/JNK1比值的上调；加入1mM浓度的ALC时上述指标均被改善。同时8小时饥饿下调LC3bⅡ/Ⅰ比值和Beclin1的表达，增加P62的表达；1mM浓度的ALC处理逆转了上述改变。
5、1mM浓度的ALC处理将饥饿ADSCs内Bcl2/Bax复合体的解离时间点由8h推迟到16h，并促进了2h时Beclin1/Bcl2复合体的解离。
结论：
8小时饥饿处理抑制了ADSCs的增殖和迁移能力，1mM浓度的ALC则能予以改善，这可能涉及到对细胞内氧化还原状态和自噬-凋亡平衡的调节。