本文研究了不同浓度1α，25-(OH)2D3对体外培养OB增殖、分化及RANKL、OPG蛋白和mRNA表达的影响，并观察了RANKL对体外培养OC形成及骨吸收活性的影响，旨在阐明维生素D调节骨代谢的部分机制。 1.1α,25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞增殖、分化及周期的影响 2.5 g/L胰酶和1 g/L II型胶原酶两步消化法分离3-4日龄SD大鼠乳鼠颅盖骨细胞。采用倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态，碱性磷酸酶(ALP)特异染色鉴定OB。在此基础上，向培养体系中添加不同浓度的1α,25-(OH)2D3(0[无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)。作用24、48、72 h，MTT法测定OB增殖率、PNPP法测定ALP活性，流式细胞仪测定OB周期。结果显示，10-9 mol/L1α,25-(OH)2D3作用24、48、72 h均促进OB增殖(P<0.05或P<0.01)，抑制ALP活性(P<0.01)；10-8、10-7 mol/L作用24、48 h，OB增殖率与对照组差异不显著(P>0.05)，但24 h时ALP活性均明显升高(P<0.05或P<0.01)，48 h则抑制了ALP活性并使OB滞留在G2/M期(P<0.05或P<0.01)；72 h时10-7 mol/L组OB增殖率极显著低于其余各组(P<0.01)，并又使ALP活性升高(P<0.01)。说明，低浓度1α，25-(OH)2D3(10-9 mol/L)促进OB增殖，抑制其分化；中高浓度1α，25-(OH)2D3(10-8、10-7 mol/L)抑制OB增殖，促进其分化，并使细胞滞留在G2/M期。 2.1α，25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞骨架、GJIC及[Ca2+]i的影响 在OB培养的基础上，不同浓度的1α，25-(OH)2D3(0[无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)作用20 min、24 h，流式细胞仪测定[Ca2+]i；24、48 h，荧光显微镜观察F-actin及细胞间隙连接通讯(GJIC)。结果显示，20 min时，不同浓度1α，25-(OH)2D3组[Ca2+]i均显著高于对照组(P<0.05)；24 h时10-9 mol/L组[Ca2+]i则显著低于对照组(P<0.05)，其余各组间差异不显著(P>0.05)，此时10-8、10-7 mol/L组大部分细胞变得扁平，F-actin排列较对照组有序，形成应力纤维；48 h时，对照组及10-9 mol/L组F-actin表达减少，10-9 mol/L组GJIC极显著弱于对照组(P<0.01)，而10-8、10-7 mol/L组大部分细胞F-actin表达完好，GJIC均极显著强于其余两组(P<0.01)。说明，1a，25-(OH)2D3能够影响钙离子通道，同时低浓度1α，25-(OH)2D3(10-9 mol/L)抑制F-actin表达及细胞间隙连接通讯，中高浓度1α，25-(OH)2D3(10-8、10-7 mol/L)则能维持OB形态，增强细胞间隙连接通讯。 3.1α，25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞超微形态结构的影响 在OB体外培养的基础上，不同浓度1α，25-(OH)2D3(0[无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)处理48 h，扫描电镜、透射电镜观察OB超微形态结构。结果，与对照组比较，10-9 mol/L1α，25-(OH)2D3组细胞铺展较好，表面针状突起、胞内线粒体增多；10-8 mol/L1α，25-(OH)2D3组细胞趋于扁平，表面突起减少，变得细长，内质网增多；10-7 mol/L1α，25-(OH)2D3组细胞外基质中大量丝状纤维连接成网状，细胞内线粒体较少，出现大量空泡及钙颗粒沉积。说明，低浓度1α，25-(OH)2D3(10-9 mol/L)能促进OB增殖，而中高浓度1α，25-(OH)2D3(10-8、10-7 mol/L)抑制OB增殖，促进细胞外胶原形成及基质矿化。 4.1α，25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞RANKL及OPG表达的影响 在OB体外培养的基础上，不同浓度1α，25-(OH)2D3(0[无水乙醇溶剂对照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)作用24、48、72 h，分别采用ELISA及FQ-PCR法测定RANKL、OPG蛋白及mRNA含量。结果，10-8、10-7 mol/L1α，25-(OH)2D3较对照组、10-9 mol/L组显著或极显著促进RANKL蛋白及mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)；10-9、10-8 mol/L1α，25-(OH)2D3在不同时间，较对照组显著或极显著促进OPG蛋白及mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)，而10-7 mol/L则极显著抑制OPG mRNA表达(P<0.01)；最终，10-9 mol/L组48 h时RANKL/OPG比值增高(P<0.05),10-8、10-7 mol/L1α,25-(OH)2D3组RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值则始终高于对照组和10-9 mol/L组(P<0.01)。说明，1α，25-(OH)2D3可剂量依赖性地上调RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值，促进OC的生成及骨吸收功能，增强骨更新。 5.RANKL对体外培养破骨细胞形成和活化的影响 分离5-6周龄ICR小鼠长骨骨髓细胞，分两阶段培养。第一阶段分三组(A、对照组[不添加任何因子]；B、50 ng/mL RANKL；C、25 ng/mL M-CSF)培养3d，进入第二阶段(I、对照组[不添加任何因子]；II、25 ng/mL M-CSF；III、25 ng/mLM-CSF+50 ng/mL sRANKL)继续培养。倒置显微镜观察细胞形态，酸性磷酸酶(ACP)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及扫描电镜观察骨吸收陷窝，鉴定OC的生成及骨吸收活性，同时荧光显微镜观察F-actin。结果，第一阶段培养3d，对照组和50 ng/mL RANKL组细胞均无贴壁及增殖能力，而25 ng/mLM-CSF明显促进细胞贴壁与增殖。第二阶段培养2d，25 ng/mL M-CSF+50 ng/mLRANKL组较25 ng/mL M-CSF组出现更多单核巨细胞，随着时间的延长单核巨细胞增多，出现2个核以上的巨细胞，且M-CSF存在的各组细胞均可表达ACP活性；培养9d，25 ng/mL M-CSF+50 ng/mL sRANKL组出现3个核的TRAP阳性OC(10.17±1.55个/孔)，OC数极显著高于对照组(0个/孔)和25 ng/mL M-CSF组(0.67±0.69个/孔)(P<0.01)。同时，sRANKL可诱导F-actin的表达，促进骨吸收陷窝的生成。说明，RANKL在M-CSF存在时可诱导OC的生成及骨吸收活性，但OC数量仍不多。