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含硒谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是机体内最重要的抗氧化酶,已有许多GPX的人工模拟酶,但活力普遍不高。对已有的GPX模拟酶进行深入研究表明,产生底物结合位点是制备高活力GPX模拟酶的关键因素之一。单克隆抗体(McAb)制备技术是产生具有底物结合部位受体的有效手段。罗贵民小组在制备模拟GPX抗体酶的过程中,提出了疏水修饰理论并应用该理论制备了一系列具有较高GPX活力的单克隆抗体酶,在此基础上又应用基因工程方法制备了模拟GPX的小分子单链抗体(scFv)酶。这些抗体酶虽然活性较高,但来源于鼠的免疫原性限制了它们的医学应用。本研究的主要目的就是制备具有一定GPX活力的人源单链抗体酶,并在细胞水平上研究其抗氧化作用。主要开展了以下工作:1.合成抗原GSH-S-DNPBu根据罗贵民小组提出的疏水修饰理论合成了谷胱甘肽(GSH)的类似物GSH-S-DNPBu,用核磁共振对合成的化合物进行了分析。2.亲和筛选抗GSH-S-DNPBu的噬菌体单链抗体通过吸附-洗脱-扩增步骤,从噬菌体展示人源单链抗体库(human synthetic VH+VL scFv library)中亲和筛选抗GSH-S-DNPBu的噬菌体单链抗体。用“多克隆噬菌体ELISA”监测筛选过程并用“单克隆噬菌体ELISA”选择可以和GSH-S-DNPBu特异性结合的单克隆噬菌体。3.表达和纯化人源单链抗体根据“单克隆噬菌体ELISA”结果,提取选择的单克隆噬菌体DNA,应用PCR方法从噬菌体DNA中扩增出编码人源单链抗体的基因,将其克隆到分泌性表达载体pPELB中并转化大肠杆菌Rosetta,诱导转化菌Rosetta表达人源单链抗体。用Ni2+螯合亲和层析(IMAC)纯化可溶性表达的人源单链抗体。应用SDS-PAGE和western blot实验鉴定表达和纯化的人源单链抗体。4.制备人源含硒单链抗体酶用化学突变法将人源单链抗体中的丝氨酸转变为硒代半胱氨酸(Sec),得到具有GPX活力的人源含硒单链抗体酶,其活力为1288 U/μmol。5.在细胞水平上研究人源含硒单链抗体酶的抗氧化作用利用H2O2损伤大鼠乳鼠的心肌细胞建立氧化应激损伤模型,应用MTT法,丙二醛(MDA)测定试剂盒,乳酸脱氢酶(LDH-L)比色法试剂盒,流式细胞仪和活性氧测定试剂盒检测受损细胞的存活率、脂质过氧化程度、心肌细胞膜完整性、线粒体膜电位和细胞内ROS水平等指标的变化以及人源含硒单链抗体酶对上述指标的影响。结果表明人源含硒单链抗体酶能部分的增加心肌细胞存活率,减少脂质过氧化产物MDA生成,降低由于细胞膜完整性受损而引起的LDH泄漏,恢复线粒体膜电位,降低细胞内ROS含量,表明人源含硒单链抗体酶具有很强的抗氧化能力和良好的药用前景。