神经环路(neural circuit)由神经元以及突触联接构成,是神经网络组成的最基本结构。目前,对于海兔(Aplysia)摄食神经环路的研究主要包括环路的具体组成元件——神经元以及特定神经元所含有的神经递质。前期研究表明,海兔摄食神经环路中,负责齿舌(radula)伸长的关键神经元是胆碱能的。然而,对于负责齿舌回缩的关键中间神经元是通过何种神经递质发挥作用的研究却还不够深入,只有少数研究表明这类神经元可能是谷氨酸能的。传统的谷氨酸能神经元鉴定方法比较单一,比如单一的药理学实验或者单一的分子生物学鉴定。药理学实验鉴定谷氨酸能神经元的缺点是鉴定结果特异性不高,因为实验过程中采用的大多数药物通常是在脊椎动物相关研究中被使用过,当这些药物被运用到无脊椎动物中时就可能存在特异性问题；分子生物学实验鉴定谷氨酸能神经元虽然特异性较高,但是该方法不能直接研究谷氨酸能神经元的功能。因此,多学科方法综合研究谷氨酸能神经元及其功能就显得很有必要。本文通过多学科手段,包括生物信息学、分子生物学、药理学、电生理等,第一次在无脊椎动物中证明了具有转运功能的囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters, VGLUTs),并且成功鉴定出海兔摄食环路中一个关键的控制齿舌回缩的中间神经元——B64神经元是谷氨酸能的细胞,而且可以同时通过谷氨酸能突触产生兴奋性和抑制性突触后联系。在本课题研究之前,我们的合作者通过B64神经元与已知的非谷氨酸能细胞的表达差异性分析而克隆得到了B64神经元中一段特异性cDNA序列。在本课题研究中,我们首先将这段特异性cDNA序列进行了生物信息学分析,结果显示这段序列不论在序列上还是疏水性质方面都与已报道的囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters, VGLUTs)存在极高的相似性,这表明B64神经元极有可能具备了典型的谷氨酸能神经元特性,即含有谷氨酸能突触活动必不可少的分子——囊泡谷氨酸转运体(VGLUT)。因此,我们将这段序列命名为海兔囊泡谷氨酸转运体(Aplysia vesicular glutamate transporter, ApVGLUT)。而且有趣的是,进化树分析结果显示,较于果蝇和线虫的VGLUTs,海兔的ApVGLUT在亲缘关系上更接近哺乳动物。随后,我们又利用合作者提供的ApVGLUT-pcDNA3重组质粒成功在COS7细胞系中表达了一种依赖ATP和质子浓度梯度转运谷氨酸的转运蛋白,该结果表明ApVGLUT确实是一种新的囊泡谷氨酸转运体。神经节免疫荧光实验证明B64神经元确实含有ApVGLUT.同时,药理学实验证明B64神经元产生的EPSPs和IPSPs是通过神经递质谷氨酸介导的。最终,我们通过多学科手段相结合的方法,成功证明了B64神经元是谷氨酸能的。综上所述,在海兔摄食神经环路中,B64中间神经元通过囊泡谷氨酸转运体转运谷氨酸并以此作为主要神经递质从而产生兴奋性和抑制性突触后联系,最终控制齿舌回缩动作的发生。值得一提的是,我们建立的这套综合性多学科方法有望对其它模式动物中可识别神经元神经递质种类的鉴定及功能研究提供重要参考价值。