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松材线虫是松树的毁灭性病原,但迄今其致病机理不甚清楚。松材线虫虫体前端包括食道腺、头感器、表皮以及分泌系统等一些与致病相关的重要器官,构建其特异性文库将有助于分离鉴定松材线虫的寄生致病相关基因,将为进一步揭示致病机制提供重要依据。
本研究在Huang等人的固相消减杂交基础上进行了改进,提高了消减杂交过程中的稳定性与可靠性,杂交后未能检测到持家基因,杂交效果达到了预期设想。构建的松材线虫体前端cDNA文库约含6000个阳性克隆,随机挑取其中400个阳性克隆进行PCR检测,凝胶电泳显示其片段大小在200bp~1000bp之间,其中大于400bp的片段有79条,占片段总数的19.8%。将大于400bp的片段进行测序,得到48条序列。以虫体前端和后端cDNA作为探针进行反向Northern杂交验证,结果显示35条片断是在松材线虫身体前端表达的。经过BLASTX分析发现,所得序列均未被报道过。其中编号为Bx0B38的序列与大豆胞囊线虫类毒敏原蛋白有37%相似性,其cDNA全长为637bp,编码产物为152个氨基酸,含有119bp5’非编码区和59bp3’非编码区,其中3’非编码区含有多聚腺苷酸化信号(AATAAA);对Bx0B14分析发现,其cDNA片段长度为389bp,编码产物与马铃薯金线虫的EXPB2protein相似性为46%,E-value为1e-17。与马铃薯金线虫的EXP1protein相似性为45%;对序列Bx0C65的分析发现,cDNA片段长度为419bp,编码产物为117个氨基酸,编码产物与秀丽小杆线虫的HAlFtransporter基因家族有较大同源性,与HAlFtransporter(PGPrelated)familymember(haf-3)基因有70%的相似性。
本研究为进一步分离鉴定松材线虫寄生致病相关基因提供了重要材料。