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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疾病,又称“猪蓝耳病”。该病以怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪和育肥猪的呼吸道症状为特征,给世界养猪业造成具大损失。PRRSV变异性极强,目前已证实我国2006年爆发的高热病的病原为PRRSV变异株,遗传变异分析表明,与传统PRRSV相比,主要是在Nsp2基因发生较大的基因缺失。本实验通过比较PRRSV变异株与弱毒株感染机体后,肺泡巨噬细胞(PAM)表达细胞因子在mRNA水平上的变化差异,以期阐明PRRSV变异株对PAM免疫功能的影响与弱毒株的异同,从而为分析PRRSV变异株感染与机体严重的病理反应之间有何关系奠定基础。本研究从若干PRRSV毒株中通过RT-PCR、测序的方法筛选出了Nsp2基因发生30个氨基酸缺失突变的变异毒株,命名为FZ06A,并与弱毒株VA一同进行了攻毒实验。结果显示,FZ06A组猪只在攻毒后第10d全部死亡,剖检发现实验猪的临床病理变化同文献报道的2006年流行毒株引发的猪只病理变化相似。应用RT-PCR,分别扩增PRRSV N基因和猪肺泡巨噬细胞(PAM)促炎细胞因子(IL-1β与IL-6)、先天性细胞因子(TNF-α、TNF-β与IFN-γ)、Th1型细胞因子(IFN-α、IL-2与IL-12p40)、Th2型细胞因子(IL-4)、调节性细胞因子(IL-8)和抑制性细胞因子(TGF-β与IL-10)的部分基因片段,克隆至pEASY-T1载体得到重组质粒。经PCR和酶切鉴定并测序,获得了各阳性标准质粒。通过荧光定量PCR(Real-time PCR)方法建立了标准曲线,计算得到了扩增效率,扩增效率均在90%-105%之间,相关系数R2值均在0.99以上,表明各反应体系均符合实验要求。分别用变异毒FZ06A和弱毒株VA感染30日龄仔猪,于2、4、8、10DPI迫杀实验猪并灌洗猪肺泡巨噬细胞(PAM),采用荧光定量PCR技术对PAMs中促炎细胞因子(IL-1β与IL-6)、先天性细胞因子(TNF-α、TNF-β与IFN-γ)、Th1型细胞因子(IFN-α、IL-2与IL-12p40)、Th2型细胞因子(IL-4)、调节性细胞因子(IL-8)和抑制性细胞因子(TGF-β与IL-10)的mRNA转录水平进行分析。结果显示,FZ06A感染早中期,即8DPI之前,VA感染早期,即4DPI之前,促炎细胞因子IL-1β和IL-6 mRNA转录水平均下调,4DPI达到最低。VA组在8 DPI开始升高,在10 DPI达到最高,其中IL-1β差异显著(P<0.05)。FZ06A感染后,先天性细胞因子的表达受到抑制;VA感染后,先天性细胞因子的表达也受到一定程度抑制,但是程度整体比变异株病毒轻,表现在VA病毒感染后, IFN-γ、TNF-α和TNF-β在10 DPI时明显上升,且差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.001);而FZ06A感染后,除TNF-α在10DPI显著上调(P<0.05)外,其余因子均处于下调或微上调水平。但IFN-γ例外,VA病毒感染8DPI前下调幅度较大,而FZ06A病毒感染只有2DPI下调,其他时相虽上调不显著,但是一直有低水平表达。FZ06A与VA感染后,Th1型细胞因子的表达均受到抑制,但是VA组程度比FZ06A组轻。表现在VA病毒感染后,IL-12和IFN-α在10 DPI时明显上升,尤其IFN-α的表达差异显著(P<0.05),且IL-2水平一直处于上调状态;而FZ06A感染后,各因子均处于下调或微上调水平,IL-2表达水平变化趋势同VA,但只有在8DPI上调,其余时相下调,这也进一步说明了FZ06A感染对其表达抑制程度更高。变异株FZ06A感染后,Th2型细胞因子IL-4 mRNA转录水平在2DPI小幅上调,4-8DPI时表达下调,4DPI达最低,10DPI开始上调。VA病毒感染8DPI之前, IL-4的mRNA转录水平一直是下调,10DPI上调,比FZ06A感染组上调幅度大,但差异不显著。实验结果表明,FZ06A和VA感染后,Th2型细胞因子的表达也受到抑制。在PRRSV变异株FZ06A感染早中期,即8DPI之前,VA感染早期,即4DPI之前,IL-8 mRNA转录水平下调,4DPI达到最低,在8 DPI开始升高,VA组在10 DPI达到最高,两组间在10 DPI差异显著(P<0.05)。实验结果表明机体受到病毒感染后,IL-8的表达受到抑制,而且PRRSV变异株病毒比VA病毒有更强的抑制作用。变异株病毒FZ06A感染后,TGF-βmRNA转录水平在实验进程中一直处于下调状态,4DPI显著下调(P<0.05),8DPI时略有提高,但不显著,且在10DPI时表达水平再次下调,与对照组相当;IL-10 mRNA转录水平在2-8DPI一直处于下调状态,10DPI有小幅上调。VA组TGF-βmRNA转录水平在2-4DPI表达下调,4DPI达最低,但不显著,在8DPI显著上调(P<0.05),10DPI有所下降,但与对照组相比仍差异显著(P<0.05);IL-10的mRNA转录水平在8DPI之前一直是下调,10DPI上调,比FZ06A感染组上调幅度大,但差异不显著。可见,FZ06A对抑制性细胞因子mRNA水平的表达比VA有更强的抑制作用。综合以上结果表明,变异株病毒对PAM促炎细胞因子、先天性细胞因子、Th1型和Th2型细胞因子、调节性细胞因子以及抑制性细胞因子的mRNA水平的表达比VA病毒均有更强的抑制作用,严重影响了机体对PRRSV和其他病原微生物的免疫应答,造成免疫抑制。