基因组编辑技术是对目标基因组进行“编辑”,实现针对基因组特定DNA片段的删除、插入或修饰的技术。传统的基因组编辑技术是通过生物体自发的同源重组修复机制实现的,效率极低。研究发现在基因组靶位点特异性的引入双链断裂,细胞中同源重组的效率可以大幅度提高。锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)可以引入特异性位点的DNA双链断裂,因此大大加速了基因组编辑技术的发展。但是活性ZFN筛选困难,TALEN组装繁琐,改造周期长,经济、人力成本高昂,阻碍了两种核酸酶技术的发展和应用。CRISPR/Cas9技术是近年来发展起来的一种新兴的人工核酸酶基因编辑技术。该技术来源于细菌的一种免疫机制,通过不断的研究改造而成,主要由Cas9蛋白和识别靶位点的gRNA组成。自2012年,Jinek et al证实了CRISPR/Cas9系统可以在体外对双链DNA分子进行定点切割后,该技术迅速发展,极短的时间内在一系列物种的基因组编辑研究中得到了广泛的应用。本研究中我们利用本实验室前期开发的源于嗜热链球菌的CRISPR/Cas9系统和用于基因组编辑阳性细胞富集的SSA-RPG双报告载体系统,成功实现了鸡DF-1细胞和猪肾原代成纤维细胞中相关基因的高效敲除;另外,我们还开发了基于CRISPR/Cas9介导HR和SSA修复机制的两步法无缝编辑技术。1.利用CRISPR/Cas9技术结合SSA-RPG报告载体系统实现了鸡DF-1细胞中EDN3、ATP5E和OVA基因的高效敲除。将CRISPR/Cas9表达载体和SSA-RPG报告载体共转染鸡DF-1细胞,转染48 h后通过荧光显微镜观察,DF-1细胞中检测到了红色荧光和绿色荧光,初步证明了CRISPR/Cas9系统在鸡DF-1细胞中工作。收集转染48 h后的DF-1细胞提取基因组进行T7E1检测,EDN3、ATP5E和OVA三个基因的突变效率分别为0.7%、0.5%和3.0%。利用SSA-RPG报告载体中的PuroR报告基因能够通过嘌呤霉素筛选实现基因组编辑阳性细胞的高效富集。通过对DF-1细胞进行嘌呤霉素药物敏感性检测,确定了DF-1细胞嘌呤霉素筛选的合适浓度为3μg/mL,筛选时间为4天。对转染后48 h的DF-1细胞添加3μg/mL嘌呤霉素的培养基连续筛选4天,富集基因组编辑阳性细胞,收集细胞提取基因组DNA后进行T7E1检测,结果表明EDN3、ATP5E和OVA三个基因的突变效率分别提高到45.3%,61.3%和47.3%,进一步的T-A克隆和测序分析结果表明三个基因的突变效率均高达95%。针对三个基因的靶序列分别选择3个潜在的脱靶位点进行T7E1检测,没有发现明显的脱靶现象。这些结果说明利用CRISPR/Cas9技术和SSA-RPG报告载体系统能够实现鸡细胞基因组的高效编辑,为鸡基因组编辑研究提供了借鉴。2.利用CRISPR/Cas9技术结合SSA-RPG报告载体系统实现了猪肾原代成纤维细胞中RELA基因的高效敲除和阳性细胞克隆的筛选。首先设计了三条靶向RELA基因的gRNA,构建相应的CRISPR/Cas9表达载体和SSA-RPG报告载体,共转染HEK293T细胞,通过观察并比较绿色荧光/红色荧光的情况,初步判断这些gRNA的活性,结果表明RELA2.CRISPR/Cas9活性最高。为了提高猪肾原代成纤维细胞的电转效率,我们尝试在电转缓冲液中添加LMA1和LMP8,研究结果表明,当加入4%的LMP8时,电转效率显著提高。采用此电转缓冲液,将RELA2.CRISPR/Cas9表达载体和SSA-RPG报告载体共转染猪肾原代成纤维细胞,转染48 h后通过荧光显微镜观察,细胞中检测到了红色荧光和绿色荧光,初步证明了CRISPR/Cas9系统在猪肾原代成纤维细胞中工作。对转染后的细胞进行嘌呤霉素筛选,挑取阳性细胞单克隆提取基因组DNA进行T-A克隆和测序分析,结果显示所有阳性克隆的RELA基因都发生了突变,并且双等位突变的效率高达到80%。本研究表明利用CRISPR/Cas9技术和SSA-RPG报告载体系统能够更进一步地实现猪肾原代细胞基因组的有效编辑以及阳性细胞克隆的有效筛选,为猪基因组编辑及育种研究积累了经验。3.基于细胞DNA修复的HR和SSA原理,设计和开发了一种新型的基因无缝编辑技术。该技术首先在HEK293T细胞的CCR5基因无缝编辑中进行了尝试和优化研究。首先构建了靶向CCR5基因和eGFP基因的CRISPR/Cas9表达载体,同时构建了含有TK-PuroR-eGFP正向和负向筛选标记表达盒的HR/SSA-Donor载体。将CCR5.CRISPR/Cas9表达载体和供体Donor载体共转染HEK293T细胞,进行第一步打靶实验,Donor DNA通过HR修复机制整合到HEK293T基因组CCR5基因位点中,同时通过Donor载体中的同源臂引入目标突变(?32/SalⅠ),通过PuroR-eGFP报告基因实现阳性细胞克隆的荧光观察和药物筛选,进一步检测结果表明阳性细胞克隆同源重组效率高达100%,并且针对CCR5.CRISRP/Cas9没有检测到明显的脱靶效应。挑取第一步得到的阳性细胞克隆扩大培养后转染eGFP.CRISRP/Cas9表达载体,进行第二步打靶实验,通过SSA修复机制和更昔洛韦负向筛选实现TK-PuroR-eGFP组件的无痕迹删除,最终实现了将CCR5基因中32 bp目标位点替换为SalⅠ酶切位点的?32/SalⅠ突变,突变效率为2.08%,同样针对eGFP.CRISRP/Cas9没有检测到明显的脱靶效应。基于CRISPR/Cas9介导HR和SSA修复机制的两步法无缝编辑技术能够实现阳性细胞克隆的高效筛选和筛选标记组件的无痕迹删除,为基因组精确编辑提供了一种有效的技术手段。