香蕉RT-Qpcr研究中内参基因的筛选及MaEBF1/2在果实成熟过程中的表达分析

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香蕉是典型的呼吸跃变型水果,不仅对乙烯敏感,而且对机械伤、低温、高温和病菌胁迫等非常敏感。为进一步了解乙烯在香蕉果实成熟过程中的作用机理,本研究克隆了2个乙烯信号转导重要元件MaEBFs基因,并分析了其在果实成熟过程中的表达特性及与乙烯信号转导组分MaEIL的互作。此外,为获得适合香蕉进行荧光定量PCR(RT-qPCR)分析的内参,本研究对各种试验条件的20个候选内参基因表达的稳定性进行了分析。主要研究结果如下:  1.通过对香蕉20个内参基因表达稳定性的分析,获得了适合各种试验条件下香蕉RT-qPCR研究的内参基因。不同处理的样本最适合的内参基因不同。香蕉不同组织部位的最适合内参基因为RPS2和RAN;香蕉果实不同发育时期的果皮为UBQ2和CAC,果肉为RPS2和RAN;在采后香蕉果实成熟过程中的果皮为SAMDC1和CAC,果肉为RPS4和DNAJ;低温和高温等非生物胁迫处理下的为ACT1和EIF5A-2;生物胁迫处理下的为UBQ2和GAPDH;激素处理下则是UBQ2和RAN。而对所有样本进行综合考虑时,RPS2和UBQ2则是最适合的内参基因。上述结果为今后在香蕉研究中进行准确和可靠的荧光定量分析提供了依据。  2.通过RT-qPCR和northern杂交的方法分别对目的基因MaEBF1在香蕉果实成熟过程果皮和果肉中的表达进行比较研究,验证了筛选的内参基因的有效性。结果表明,使用单一最稳定内参基因和双内参基因组合均可获得较为可信的试验结果。  3.采用RT-和RACE-PCR的方法,获得了两个EBFs基因的全长序列,分别命名为MaEBF1和MaEBF2,分别编码655和654个氨基酸。序列分析表明在MaEBF1/2的5’端有一个约45个氨基酸保守区域的F-box元件,在F-box元件后有一富含亮氨酸重复(18个)序列(Leu-rich repeats,LRRs)的结构域。MaEBF1和MaEBF2的同源性为79.54%,并与毛果杨的PtEBF4同源性最高,同源性分别为55.69%和56.23%。亚细胞定位分析显示MaEBF1/2均定位在细胞核。此外,转录激活分析表明MaEBF1/2在酵母细胞中都没有激活特性。  4.分析了MaEBF1和MaEBF2在四种不同成熟进程香蕉果实中的表达特征,结果表明,果实成熟过程中,MaEBF1/2在果皮和果肉中的表达特征不同。MaEBF1在自然成熟,乙烯催熟,1-MCP延缓成熟和1-MCP结合乙烯处理果实中,随着果实成熟,其在果皮和果肉中的表达均逐渐下降;MaEBF2在果皮中的表达与MaEBF1相似,随着果实成熟,其表达有所下降。而MaEBF2在果肉中的表达则相反,随着果实成熟,其表达明显增强,外源乙烯处理也能诱导MaEBF2在果肉中的表达。更为重要的是,酵母双杂分析表明MaEBF1和MaEBF2能与乙烯信号转导组分MaEIL5发生相互作用。上述研究结果表明MaEBF1和MaEBF2有可能通过与MaEIL5的相互作用来参与调控香蕉果实的成熟。
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