【摘 要】
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近年来植物抗虫基因工程研究进展迅速,并分离出了不少的抗虫基因,然而,针对同翅目害虫的抗虫基因却很少被分离。大量的研究结果表明,植物凝集素具有有效的抗虫作用,其中雪花莲外源
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近年来植物抗虫基因工程研究进展迅速,并分离出了不少的抗虫基因,然而,针对同翅目害虫的抗虫基因却很少被分离。大量的研究结果表明,植物凝集素具有有效的抗虫作用,其中雪花莲外源凝集素(GNA,Galanthus nivalis agglutinin)已在植物基因工程中广泛应用,并对同翅目害虫如蚜虫和褐飞虱等表现出较好的抗性。 本实验采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of eDNA ends,RACE)技术,首次从中国特有的野生植物韭莲(又名风雨花,Zephyranthes grandiflora)的叶片中分离克隆出了一个新的凝集素基因,对基因进行了序列分析和功能预测,并成功地构建了韭莲凝集素基因的植物表达载体和原核表达载体。为今后研究该基因的分子进化、功能表达及农作物的抗虫基因工程等奠定了基础。具体的实验结果如下: 1.基因克隆及序列分析:根据石蒜科(Amaryllidaceae)植物凝集素的保守区段,设计引物,采用RACE技术从韭莲中克隆出长度为952bp的新凝集素基因,包含了完整的编码序列(576bp),它编码一个全长191个氨基酸的蛋白,与雪花莲外源凝集的相似性达59%,被命名为ZGA(Zephyrathes grandiflora agglutinin)。对该基因所推导出的氨基酸进行了信号肽剪切位点分析、蛋白质结构域分析和专一结合糖基化分析,结果表明与其他石蒜科种类的凝集素非常相似。推测此基因具有与GNA相似的抗性功能。 2.植物表达载体的构建:在韭莲凝集素基因(zga,Zephyrathes grandiflora agglutinin gene)克隆的基础上,构建了植物双元表达载体p2300zga,并成功地导入到农杆菌EHA105中。 3.原核表达载体的构建:将韭莲凝集素成熟蛋白的编码序列构建到原核表达载体pET32a(+)中,并已经成功地转化到表达宿主菌BL21中。
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