论文部分内容阅读
透明质酸（Hyaluranic acid,HA）广泛应用于医学、化妆品、食用等领域,市场需求日益增大,预计2019年将达到98.5亿美元。HA的生物活性取决于其分子量（Mw）,相比于大分子量的HA,HA寡糖由于具有重要的生理活性与特殊生理功能,在医药领域具有广阔的应用前景。当前,HA寡糖的制备方式普遍是先通过动物组织提取或微生物发酵获得HA,再通过物理法、化学法或酶解法获得,这样的制备方式工艺复杂,经济性差,无法满足市场对HA寡糖的需求。随着代谢工程和分子生物学领域的重大进展,通过构建工程菌株一步法发酵获得HA寡糖的方式非常有前景和吸引力。兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在生物合成HA或HA寡糖方面有自身的优势,市场上现有的HA超过90%是来自于它们所生产的,它们在生物发酵HA或HA寡糖方面是人们重点研究与应用的平台。本论文以兽疫链球菌和枯草芽孢杆菌为研究对象,应用多种策略对其HA寡糖代谢途径进行优化,实现了HA寡糖的高产。主要结论如下:（1）在Streptococcus zooepidemicus WSH-24中过表达nisA启动子控制下的HasA（透明质酸合酶）,确定在80 g·L-1葡萄糖浓度下Nisin终浓度为40 ng·m L-1最佳。通过LHAase（水蛭来源的透明质酸酶）的N-端融合6个His标签和RBS序列优化策略,实现LHAase在兽疫链球菌中分泌表达,重组菌的LHAase的最大酶活达到11113.2 U·mL-1。通过同时过表达HasA和优化表达水蛭来源的LHAase,解决了发酵过程的溶氧问题并实现了HA寡糖的高效发酵合成。重组菌株摇瓶发酵24 h时HA寡糖积累至0.97 g·L-1,比野生菌提高了182.0%。3 L发酵罐中发酵24 h时HA寡糖积累至7.06 g·L-1,比野生菌的罐上水平提高了112.4%。（2）在Bacillus subtilis 168中优化HA寡糖代谢途径,通过启动子工程和表达同工酶策略,在枯草芽孢杆菌中共表达sz HasA（兽疫链球菌来源的透明质酸合酶）与pmHasA（多杀性巴氏杆菌来源的透明质酸合酶）,摇瓶发酵24 h时HA产量达到0.49 g·L-1。通过基因组上整合过表达P43启动子调控的途径基因glmM（编码乙酰基转移酶）、glmS（编码果糖-6-磷酸酰胺转移酶）、glmU（编码焦磷酸化酶）、tuaD（编码UDP-葡萄糖脱氢酶）,实现HA前体的强化。通过基因组上整合表达P43启动子调控的水蛭型透明质酸酶基因LHyal,实现了HA寡糖的高效合成。通过敲除自溶相关基因lytH（编码孢子形成特异性L-Ala-D-Glu内肽酶）、lytG（编码N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）、lytD（编码N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）、lytC（编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶）,不仅提高重组菌生物量,而且有益于HA寡糖产量的提高。最终,摇瓶发酵24 h时HA寡糖产量达到1.54 g·L-1。（3）构建枯草芽孢杆菌转录后调控系统bsrE/sr5,并通过应用于调控绿色荧光蛋白GFP与分裂起始蛋白Fts Z,证明该系统具有良好的适用性与可靠性。将调控系统bsr E/sr5应用于降低HA旁路途径相关基因表达,使用内源Ⅳ类组成型较弱启动子PsigW调控sr5的表达量来下调旁路途径zwf（编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、pfkA（编码6-磷酸果糖激酶）、mnaA（编码UDP-N-乙酰甘露糖胺-2-差向异构酶）、mur AA（编码UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯基转移酶）、murAB（编码UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯基转移酶）基因的表达水平,实现了在保持细胞正常生理活动的同时提高HA寡糖产量,OD600基本维持在9左右,而HA寡糖产量大幅度提高,摇瓶发酵24 h时达到2.51 g·L-1。（4）通过在3 L发酵罐上进行分批补料发酵,实现了高效生物合成HA寡糖。枯草芽孢杆菌重组菌株BSha34分批补料发酵40 h时HA寡糖的产量达到12.6 g·L-1,生产强度为315.0 mg·（L·h）-1,所构建的重组菌在HA寡糖生产方面具有明显优势。