论文部分内容阅读
核转录因子NF-κB调控多种细胞学过程,包括细胞增殖、分化和凋亡等,特别在免疫和炎症反应中起关键的调控作用。泛素连接酶TRAF6分子是NF-κB通路中关键的接头分子,通过介导TNF受体超家族和IL-1R/TLR超家族信号转导在调节先天免疫应答中起重要作用。NF-κB信号通路必须受到严谨的调控才能使机体维持正常的稳态,泛素化和去泛素化修饰在此通路中起关键的分子开关作用。圆柱瘤基因CYLD编码一种重要的去泛素化酶,去泛素化NF-κB通路中很多关键分子,从而负调节该通路。但是,CYLD被募集到靶蛋白上行使去泛素化功能的分子机制还不清楚。G蛋白偶联受体激酶结合蛋白(GIT1和GIT2)是含有多个结构域的分子,在很多种组织中都广泛分布,它们通过与细胞内的其他蛋白(例如ARF、Rac1和Cdc42、PAK、PIX、MEK1、PLCγ等)的相互作用调节这些分子在不同的细胞区室内运动。而且,GITs作为一种支架蛋白控制信号分子的活性,如能够直接与MEK1和ERK1激酶相互作用调控ERK信号通路。重要的是,GIT2基因敲除小鼠出现脾肿大的表型,而且对于细菌具有易感性。并且,GIT2对胸腺细胞的正选择起关键的调控作用。这些结果说明GIT2在免疫调控方面发挥重要功能。但是,迄今为止没有文献报道GIT2对NF-κB信号通路有直接的调控作用。我们通过酵母双杂交技术以GIT2为诱饵,筛选到包括NEMO、ABIN-1、A20、TRAF1、SPOP等在内的6种与NF-κB通路相关的蛋白,提示GIT2可能在调控NF-κB信号通路中发挥功能。我们进一步通过免疫共沉淀方法确定了GIT2与TRAF1的相互作用。接着,我们分析了GIT2与TRAF家族相互作用的特异性,发现GIT2与除了TRAF4外的TRAF家族其他成员均存在相互作用。我们对TRAF6与GIT2的相互作用进行深入的研究,发现GIT2与TRAF6的相互作用在细胞因子IL-1β的刺激下显著增强。为了深入分析GIT2与TRAF6相互作用对NF-κB信号通路的调控,我们通过报告基因实验的方法,在HEK293细胞中过表达GIT2蛋白后,用IL-1β或LPS刺激,我们发现GIT2能够负调控NF-κB的转录激活。除了用细胞因子直接刺激外,我们还过表达NF-κB通路中关键的正调控分子来激活该通路,发现GIT2能够抑制MyD88、TRADD、TRAF家族分子、cIAP1、RIP1、IKKα和IKKβ对通路的激活,但是不能抑制转录因子p65对于通路的激活。此结果提示GIT2调节NF-κB通路中p65转录因子上游的分子。接着,我们研究了GIT2负调节NF-κB通路的分子机制,发现GIT2过表达能抑制TRAF6的自身泛素化。通过构建GIT2一系列的截断体,发现其SHD和ANK结构域介导与TRAF6的相互作用。同时,GIT2通过募集去泛素化酶CYLD到TRAF6上,促进CYLD对TRAF6的泛素化。同样,SHD和ANK结构域在GIT2与CYLD相互作用过程中发挥关键作用。为了进一步研究GIT2负调控NF-κB信号通路的生理功能,我们引进了GIT2基因敲除的小鼠。在脂多糖LPS的刺激下,GIT2敲除的小鼠骨髓巨噬细胞中IкBα抑制蛋白降解的时间和ERK激酶的磷酸化时间显著长于野生型对照小鼠骨髓巨噬细胞。NF-κB信号通路活化会引起多种炎症细胞因子的上调。在LPS刺激条件下,GIT2敲除的小鼠骨髓巨噬细胞分泌更多的白介素-6和肿瘤坏死因子。与此结果类似,通过向小鼠体内直接腹腔注射LPS后取血清进行ELISA实验发现,GIT2敲除小鼠分泌的白介素-6和肿瘤坏死因子同样多于野生型小鼠。此外,我们还发现了一个新的TRAF6相互作用分子STAT3。它是一种JAK-STAT通路中的转录因子,调控很多细胞功能,如细胞增殖、分化、免疫反应及肿瘤发生。当细胞受到外界刺激时,JAK蛋白激酶被激活,激活的JAK家族能够磷酸化STAT家族,磷酸化的STAT家族分子转位到细胞核中,激活多种凋亡与增殖相关蛋白的表达。但是,很多细胞因子,如IL6,同时激活NF-κB和JAK-STAT通路的分子机制不清楚。我们在实验中意外的发现了TRAF6与STAT3的相互作用。接着,我们发现TRAF6能够促进STAT3的泛素化,但是不影响STAT3的蛋白量。而且,TRAF6能够激活STAT3信号通路。TRAF6的N端RING结构域和TRAF型锌指结构域结构域在激活过程中发挥重要的作用。另外,我们发现TRAF6能够激活STAT3转录因子的靶基因,如MCL1和Bcl2。