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本研究利用斑马鱼APP基因启动子调控绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)基因,通过显微注射方法建立绿色荧光蛋白标记的早老性痴呆(Alzheimer’s disease, AD)转基因斑马鱼模型,目的是为早老性痴呆治疗药物快速筛选提供直观的动物模型。方法1.通过聚合酶链式反应(PCR)方法从斑马鱼基因组中钓取APP基因启动子序列,克隆入pEGFP-N1载体多克隆位点,筛选出阳性克隆,测序正确后线性化回收线性化目的片段,定量,显微注射到斑马鱼受精卵单细胞,在不同时间点观察荧光表达情况。2. SH-SY5Y神经细胞为模型,利用无糖厄尔氏液和连二亚硫酸钠混合液培养细胞造成缺糖/缺氧,模拟血栓情况下的缺糖/缺氧状态,用来研究额尔顿-乌日勒对血栓致神经细胞损伤的预防和治疗作用。3.β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor proteinAD), APP在病理条件下由β分泌酶剪切后再由Y分泌酶剪切形成Aβ40、Aβ42等大小不同的肽段沉积于脑内。大量的研究证据表明β淀粉样蛋白(amyloid protein,βAP)是老年斑的主要结构物质,Aβ具有神经毒性,能促进神经细胞凋亡,Aβ被认为是AD发生的早期触发因素。AD患者脑内Aβ大量沉积形成老年斑,利用Aβ作用SH-SY5Y神经细胞,模拟脑内神经毒性致神经细胞凋亡,在给予Aβ25-35同时或作用24小时后给予额尔顿-乌日勒水浸出液,通过流式细胞术观察细胞凋亡情况。4.额尔顿-乌日勒水浸出液对转基因斑马鱼作用的观察研究。结果1.研究结果,转基因斑马鱼阳性率2%,绿色荧光在8天开始表达,逐渐增强直到60天。2.结果表明额尔顿-乌日勒对缺糖/缺氧情况下的细胞损伤有预防作用,MTT法测定灰度值差异极显著(P<0.01)；对缺糖/缺氧情况下的细胞损伤的治疗作用有差异,但差异不显著。3.额尔顿-乌日勒水浸出液对Aβ25-35所致SH-SY5Y神经细胞损伤有预防作用,差异显著(P<0.05)：但Aβ25-35作用24小时后给予额尔顿-乌日勒水浸出液用以治疗Aβ25-35对SH-SY5Y(?)申经细胞损伤,差异不显著。4.额尔顿-乌日勒水浸出液对转基因斑马鱼的荧光表达有抑制作用。结论本课题所采用的研究方法可行,实验设计合理,观察指标特征明显,结果准确,为研究早老性痴呆的治疗药物筛选提供可靠的方法学。