原发性肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上常见的恶性肿瘤之一,其具有起病隐匿、恶性程度高、进展迅速、易转移、病死率高、总体预后不佳等特点。最新统计显示,全球每年新发肝癌病例多达78万例,并且每年约75万例死于该病。在我国,肝癌发病人数约占世界总人数的一半,所以肝癌是威胁我国人民健康和生命的一大杀手。目前手术治疗仍然是治疗肝癌最主要最有效的方法,但是由于肝癌发病速度快,早期患者没有明显的症状了,确诊时往往是属于肝癌晚期,错过了最佳的手术时期。因此,探索肝癌发生发展以及其早期转移的具体分子机制对于肝癌早期诊断及提高肝癌患者预后具有十分重要的价值。随着高通量测序技术的发展和完善,一些原本被认为是"垃圾基因"的大量非编码RNA及其在生物体内的作用被不断地阐明。长链非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNA)作为非编码RNA中的重要一员,是一类不编码蛋白的,转录本长度超过200nt的RNA分子。其参与包括基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录后调控。蛋白质功能调节等重要生命活动过程,此外其在肿瘤的发生发展过程中也扮演者重要的角色。在人类基因组中,有近11%的基因是以"头对头"的方式排列,并被同一个启动子双向调控,这其中就包括LncRNA和编码蛋白基因配对。大多数的双向启动子调控方式是共表达,而有少部分会产生相反的作用。视网膜母细胞瘤基因1(RB1)是第一个被发现的抑癌基因,大量研究表明,RB1基因的抑癌作用与多种肿瘤的细胞周期、细胞分化、衰老、凋亡等调控密切相关。本研究基于前人的大量研究结果,聚焦与RB1共用同一启动子的长链非编码RNA00441,探究lnc00441是否能够通过调控RB1的表达从而影响肝癌发生发展的具体机制。本研究采用蛋白质组学等高通量测序技术,生物信息学分析,经典分子生物学实验技术等方法在体外肝癌细胞水平,体内裸鼠模型水平和临床肝癌组织中对linc00441通过对RB1调控从而影响肝癌发生发展过程中生物学行为和调控机制进行较为深入的研究。研究发现:1、长链非编码RNA00441在肝癌中异常高表达,并且与RB1在肝癌细胞系中位置有相关性,同时与患者的临床病例指标密切相关.首先我们利用qRT-PCR的方法,在80对肝癌和癌旁组织及16个正常肝组织中检测lnc00441及RB1的表达量,我们发现相对于癌旁和正常肝组织肝癌组织中的lnc00441表达异常增高,而RB1的表达量反而减少。Pearson相关性分析表明二者呈现负相关。原位杂交实验(ISH)表明lnc00441与RB1在肝癌细胞系中存在表达位置上的相关性,表明二者空间位置的相关性。此外临床资料分析显示高表达lnc00441的病人往往表现为更大的肿瘤。2、lnc00441可以增强肝癌细胞的增殖能力。我们通过慢病毒系统敲除和过表达lnc00441,从肝癌细胞系水平检测经过处理后的肝癌细胞系的增殖能力,发现过表达lnc00441的肝癌细胞G1期比例明显减少从而有更强的增殖能力。同时利用裸鼠模型的皮下瘤实验表明,在体内的环境下,过表达的lnc00441能产生和在细胞系里一样的趋势。3、肝癌组织中lnc00441异常高表达及其调控RB1低表达的具体机制。结合生物信息学分析与已发表文献,我们发现lnc00441与RB1公用同一启动子,但二者在肝癌组织中的表达趋势却相反。通过RNA蛋白免疫共沉淀实验(RIP),我们发现lnc00441可与DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)相结合,并且在高表达lnc00441的肝癌组织中RB1转录起始点前启动子区DNA存在更高的CpG岛甲基化率,并且可被甲基化转移酶抑制剂所抑制。这表明lnc00441可通过招募DNMT3A来促进RB1启动子区域CpG的甲基化从而抑制RB1的表达。同时我们发现在高表达lnc00441的肝癌细胞中前启动区有更高的H3K27乙酰化率,并且被转录因子TCF-4所调节。综上所述,我们第一次阐述了 lnc00441可以通过调节其附近的RB1的表达来影响肝癌的进展,深入探讨了 lnc00441在肝癌组织中异常高表达及其调控RB1基因低表达的具体机制。丰富了 lncRNA在肝癌发生发展中的作用。为肝癌的早期诊断、预后的判断提供了新的靶点。