对硝基苄基(pNB)酯酶是一类特殊的酯水解酶,它属于家族Ⅶ,但与荷尔蒙敏感(HSL)家族拥有同样的GGG(A)X氧洞基序。对硝基苄基酯酶对各种酯都有较高的水解活力,并具有混杂的酰胺酶活力。本实验室前人发现枯草芽孢杆菌对硝基苄基酯酶(BSE)能高选择性地催化水解dl-乙酸薄荷酯,生成光学活性l-薄荷醇。本研究从解淀粉芽孢杆菌DSM7中克隆了一个对硝基苄基酯酶BAE,与BSE具有62%的氨基酸序列一致性。我们实验测定并绘制了BAE的底物指纹图谱,并考察了其催化多种芳香仲醇酯水解的对映选择性。1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙醇是五加前胡素、鬼臼毒素和其衍生物等药物的手性砌块,我们以该仲醇为目标产物,通过过程优化和分子改造改善BAE催化其酯水解反应的对映选择性。论文内容主要分为四个部分。第一部分,解淀粉芽孢杆菌酯酶的克隆和表征。从解淀粉芽孢杆菌DSM7中克隆了对硝基苄基酯酶的基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源表达。通过镍柱亲和层析得到BAE的纯蛋白,并考察了它的基本性质。该酶适合在30℃C以下反应,在pH8.0左右的缓冲体系中具有最高的催化活力,DSMO是适合的助溶剂。接着考察了BAE对手性芳香仲醇酯的催化活力和对映选择性,发现BAE对这些酯都表现出很高的活力,但是对映选择性并不理想。通过比较仲醇苯环上不同位置不同取代基对BAE催化对映选择性的影响,我们推测BAE活性口袋中带电氨基酸可能对其对映选择性有较大影响。第二部分,将pH指示剂用于高通量绘制酯水解酶的醇基多样性底物指纹图谱。以对硝基苯酚为显色指示剂,能高通量地检测候选酶的酯水解活力。在完成该检测方法标定并确定检测范围后,我们以两种商品酶,猪肝酯酶(PLE)和褶皱假丝酵母脂肪酶(CRL),分别作为酯酶和脂肪酶的模式酶,检验了该检测方法的实际可行性。此外,还分别考察了不同底物的酰基部分对酯酶和脂肪酶活力的影响。接着,使用这种方法为本实验室开发的包括BAE在内的典型酯酶绘制了底物指纹谱。除此之外,对于底物指纹谱的定量分析,我们提出了三个重要的特征参数。其中,对于酶底物谱广度的定量描述,我们创新地提出并采用了生态学中常用的“香农-维纳指数”(Shannon-Wiener index),从而使对酶的底物指纹谱的定量描述更加准确、更为合理。第三部分,通过过程优化改善BAE催化制备(R)-1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙醇的对映选择性。解淀粉芽孢杆菌的对硝基苄基酯酶(BAE)对乙酸1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙酯具有很高的活力,但是该酯酶却和大多水解酶一样,对映选择性不高,在30℃C反应时只表现出了很一般的对映选择性(E=35)。通过酰基优化、加入表面活性剂、降低反应温度,逐步提高反应的对映选择率。最终在十克级制备反应中,通过加入乳化剂Tween-80和降低反应温度至0℃,使酶的对映选择性和产物的光学纯度均显著提高(E～140,eep=97.0％),而且催化剂效率(S/C)和所需反应时间都优于文献值。第四部分,通过分子改造提高BAE催化制备(R)-1-(3’,4’-亚甲二氧苯基)乙醇的对映选择性。基于数据库中同源的对硝基苄基酯酶BsubpNBE的晶体结构(1C7I)模拟构建了BAE酶的蛋白结构。在酶的活性中心选择了8个突变“热点”建立突变体库。采用第二部分中建立的检测方法进行高通量筛选。得到最佳的突变体BAE-V10,不但其选择性显著提高,而且保持了原有的高活力。将BAE的几个突变体蛋白纯化后,检测了它们的动力学参数。将底物的四面体中间物形式分子对接到BAE的模型结构中,分析了野生酶和突变体V10的底物结合模式和对映选择性提高的机制。将突变酶BAE-V10的冻干制剂用于十克级制备反应,无需加入Tween-80和刻意降低反应温度,在加入10%DMSO和30℃C的条件下催化反应2.5h,转化率即可达到40%以上,酶的对映选择率和产物的光学纯度进一步提高(E～180,eep=97.8%),并且S/C可以达到40g/g。由此显著提高了BAE催化手性酯对映体拆分反应过程的技术竞争力和产业应用潜力。