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目的:原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其中约90%为肝细胞性肝癌,发病率占世界总数的43.7%,死亡率居我国恶性肿瘤死亡率第2位[1]。手术切除虽是目前肝癌首选的治疗方法,但术后效果差,复发率高,而且大多数肝癌发现时已为晚期,不能进行手术。因此,化疗在防止肝癌术后的复发和转移、治疗晚期肝癌患者、延长患者生存时间和改善生活质量方面具有重要意义。但是,肝癌细胞的强耐药性严重影响着化疗效果。大量临床资料统计显示,每年导致肿瘤患者死亡的原因中90%以上与肿瘤的化疗耐药密切相关[2]。因此,深入研究肝癌细胞耐药发生的分子机制可以为明确肝癌耐药发生机制及寻找肝癌新的治疗靶点提供理论依据。现有的研究发现miRNAs在肿瘤的耐药过程中发挥着重要作用,miR-223-5p是血液系统恶性肿瘤研究中研究的较为全面的一种miRNAs分子,其通过对靶基因的调节实现调控细胞增殖、凋亡及分化的目的,最终参与了血液系统恶性肿瘤的发生、发展及转移。目前的研究也同样发现miR-223-5p在多种实体性肿瘤组织如肝癌、肺癌、胃癌等癌组织中表达量与正常组织相比是有变化的,可见miR-223-5p作为miRNAs家族的重要成员参与了多种肿瘤发生发展过程,但miR-223-5p对肝癌耐药过程的影响至今未见报道。因此本研究旨在探讨:紫杉醇对人肝癌细胞株BEL-7402及其耐药细胞株细胞增殖率的影响以及观察人肝癌细胞株BEL-7402及其耐药细胞株中miR-223-5p表达量的差异,从而揭示miR-223-5p在肝癌耐药过程中所发挥的作用,最终为解决肝癌细胞化疗耐药提供理论依据。本研究旨在通过紫杉醇耐药细胞株的建立,检测分析miR-223-5p表达与耐药细胞株耐药性之间的效应关系,为解决肝癌细胞化疗耐药提供理论依据。方法:1常规培养肝癌细胞株(BEL-7402),并建立其对紫杉醇的耐药细胞株(BEL-7402/Taxol);2采用MTT实验方法,观察紫杉醇对人肝癌细胞BEL-7402及其耐药细胞株增殖的抑制作用;3采用qRT-PCR技术,观察人肝癌细胞BEL-7402及耐药细胞株中miR-223-5p的表达量变化。4将miR-223-5p的抑制剂miR-223-5p inhibitor转染入BEL-7402/Taxol细胞,采用qRT-PCR技术检测miR-223-5p的表达量是否改变,同时用MTT检测紫杉醇对细胞的抑制作用是否有变化。结果:1紫杉醇耐药细胞株的建立及鉴定通过持续刺激培养的方式,可以构建在含有24ug/m L的紫杉醇培养液中稳定传代的耐药细胞株BEL-7402/Taxol。无论是亲本细胞株还是耐药细胞株其细胞抑制率都是随着紫杉醇浓度的升高以及培养时间的延长而升高(P trend<0.05):即在相同的培养时间下,细胞抑制率随着紫杉醇浓度的升高而升高,在相同浓度的紫杉醇刺激下,细胞抑制率随着刺激时间的延长而升高。但是耐药细胞株在低浓度紫杉醇刺激下,其细胞抑制率随着培养时间的延长变化不大。2 BEL-7402/Taxol耐药细胞株对紫杉醇的耐药性增加紫杉醇作用24h时,其对BEL-7402及BEL-7402/Taxol细胞的IC50分别为42.81 ug/ml、363.50 ug/ml,差异有统计学意义(P<0.05);紫杉醇刺激48h条件下,其对BEL-7402及BEL-7402/Taxol细胞的IC50分别为24.08 ug/ml、160.90ug/ml,差异有统计学意义(P<0.05);紫杉醇刺激72h条件下,其对BEL-7402及BEL-7402/Taxol细胞的IC50分别为18.14 ug/ml、100.14ug/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。耐药细胞株的IC50值远高于亲本细胞株。3 BEL-7402/Taxol耐药细胞株中miR-223-5p的表达升高3.1紫杉醇在BEL-7402及BEL-7402/Taxol细胞中miR-223-5p表达量的比较:针对稳定的肝癌耐药细胞株BEL-7402/Taxol及其亲本细胞BEL-7402,分别进行miR-223-5p含量检测,结果显示与亲本细胞相比,miR-223-5p在耐药细胞株中表达增高5.70±0.33倍。3.2 BEL-7402/Taxol耐药细胞株在转染miR-223-5p抑制剂后,可抑制miR-223-5p的表达BEL-7402/Taxol细胞转染24小时、48小时及72小时后,抑制组(转染miR-223-5p inhibitor)miR-223-5p含量均低于对照组(未转染miR-223-5p inhibitor),分别为对照组miR-223-5p的(86.3±6.45)%,(77.5±5.89)%及(53.5±4.57)%。4抑制miR-223-5p表达后可减弱耐药细胞株的耐药效应终浓度为50ug/ml的紫杉醇作用48h后,对照组细胞抑制率为(13.79±3.32)%,抑制组细胞抑制率为(28.32±4.86)%,抑制组细胞抑制率高于对照组(P<0.05);终浓度为100ug/ml的紫杉醇作用48h后,对照组细胞抑制率为(39.73±2.62)%,抑制组细胞抑制率为(60.41±8.42)%,抑制组细胞抑制率高于对照组(P<0.05);终浓度为200ug/ml的紫杉醇作用48h后,对照组细胞抑制率为(55.56±7.63)%,抑制组细胞抑制率为(78.62±6.12)%,抑制组细胞抑制率高于对照组(P<0.05)。无论紫杉醇的终浓度是50ug/ml、100ug/ml还是200ug/ml,抑制组细胞的抑制率均高于对照组,说明抑制miR-223-5p之后BEL-7402/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性提高。结论:1紫衫醇对于肝癌细胞具有一定的杀伤作用;2紫杉醇长期刺激会导致肝癌细胞产生一定的耐药性;3 miR-223-5p在肝癌细胞耐药细胞株中的高表达提示其参与了肝癌对紫杉醇产生耐药性这一过程;4降低miR-223-5p的表达,可以提高肝癌细胞对紫杉醇的敏感性。