研究背景多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）是一种来源于血浆细胞的恶性血液病,是世界第二大血液肿瘤,近年来许多国家的发病率都在逐渐增加。尽管MM的诊断和治疗水平不断地提高,但常规治疗手段的治疗效果目前仍无突破性进展。近年来,随着人们对多发性骨髓瘤的细胞生物学研究的深入,分子靶向正成为研究热点。MicroRNAs（miRNAs）是进化上保守的短的非编码RNA,其长度为19-25个核苷酸。MiRNAs通过影响靶mRNAs在许多疾病（包括肿瘤）中的稳定性和翻译来调节基因的表达。MiRNAs的异常表达可作为MM诊断和预后的生物标志物,越来越多的证据表明miRNAs对MM的发生和发展至关重要。MicroRNA-26a（miR-26a）作为miRNAs家族成员之一,非特异性地表达在多种组织中,研究指出,MicroRNA-26a（miR-26a）参与多种肿瘤的发生与发展,但是其作用较为复杂,其表现功能随着肿瘤类型变化而变化。MiR-26a在MM中的生物学功能和分子机制尚不清楚。在本课题中,我们将重点探讨miR-26a在MM中的作用及潜在机制。实验目的1.通过收集MM骨髓标本及MM细胞系,检测miRNA-26a在MM中的表达情况。2.在MM细胞中过表达miRNA-26a后,检测是否能够影响MM细胞的生长。3.通过构建肿瘤异体移植模型,检测过表达miRNA-26a是否能够影响MM肿瘤的生长。4.检测在MM细胞中过表达miRNA-26a后是否能够影响MM细胞周期进程。5.在MM细胞中过表达miRNA-26a后,检测miRNA-26a是否通过靶向CDK6影响细胞增殖。6.检测在MM细胞中过表达miRNA-26a后对阿霉素细胞毒性作用的影响。实验方法1.利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MM骨髓标本和MM细胞系（H929、LP1、MM1.S、OPM2 和 U266）中 miR-26a 的表达。2.利用CellCountingKit-8法（CCK-8）检测miR-26a对MM细胞增殖和存活的影响。3.利用构建的裸鼠肿瘤异体移植模型,分析过表达miR-26a对MM肿瘤生长的影响。4.利用流式细胞术检测过表达miR-26a对MM细胞周期的影响。5.利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测过表达miR-26a对MM细胞中CDK6以及E2F1、p53和p21表达水平的影响。6.利用 microRNA.org 和 Pictar 分析 CDK6 mRNA 的 3’UTR 上 miR-26a 的结合位点,并构建了含CDK6-3’UTR野生型及突变型的报告基因质粒,用双荧光素酶报告基因进行验证。7.利用CCK-8检测过表达miR-26a联合阿霉素对MM细胞存活的影响。8.利用Western blot检测过表达miR-26a联合阿霉素对MM细胞中凋亡标志物（cleaved PARP）的影响。实验结果1.利用qRT-PCR法检测发现,与正常骨髓相比,MM中miR-26a的表达出现显著下降。此外,miR-26a 在 5 种 MM 细胞系（H929、LP1、MM1.S、OPM2 和 U266）中的表达水平均低于正常骨髓细胞。2.CCK-8检测发现,过表达miR-26a能显著抑制MM细胞的生长。3.裸鼠肿瘤异体移植模型发现,过表达miR-26a能够显著抑制裸鼠皮下MM异种移植瘤的生长。4.流式细胞分析发现,过表达miR-26a能够使MM细胞周期阻滞在G0/G1期。5.qRT-PCR和Western blot检测分析发现,过表达miR-26a能下调MM细胞中CDK6,抑制E2F1的表达水平,同时上调p53和p21的表达水平。6.通过 microRNA.org 和 Pictar 预测,发现 miR-26a 在 CDK6-3’UTR 有一段 7 个碱基完全互补配对。通过双荧光素酶报告基因检测发现,miR-26a可显著抑制CDK6-3’UTR野生型报告基因质粒的荧光素酶活性而对突变型无显著影响。7.CCK-8检测发现过表达miR-26a联合阿霉素使MM细胞的存活率明显降低。8.Western blot检测发现过表达miR-26a能增强阿霉素对MM细胞的毒性作用,过表达miR-26a联合阿霉素使cleaved PARP表达升高。结论1.miR-26a在MM骨髓组织及细胞系中低表达。2.过表达miR-26a抑制MM细胞的生长,通过阻滞细胞周期于G0/G1期来影响细胞的生长。3.MiR-26a通过靶向抑制CDK6表达来抑制MM细胞增殖发挥抑癌作用。4.过表达miR-26a能增强阿霉素对MM细胞的毒性作用。5.MiR-26a基因有望作为治疗MM新的治疗靶标。