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类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病,以滑膜慢性进行性炎症及关节破坏为主要临床表现。在RA患者的关节滑膜组织中,巨噬细胞和T细胞为主的免疫细胞大量浸润及成纤维细胞的功能异常会导致关节受损及骨和软骨损伤。巨噬细胞是RA中的关键致病细胞之一,参与RA的病程发展。许多研究表明,滑膜中巨噬细胞与多种免疫细胞和非免疫细胞相互作用,导致RA的发生发展。目前的研究表明RA的发病机制复杂,与细胞的相互作用关系密切,遗传因素和环境因素在RA的发病机制中是不可或缺的环节。同时RA患者现有的治疗手段效果不佳,患者不耐受以及严重不良反应限制了 RA患者的治疗,因此关于RA的发病机制及治疗手段都有待进一步研究。鉴于巨噬细胞在RA中的关键作用,重建关节滑膜中巨噬细胞与其他细胞的动态平衡是发现治疗RA新策略的核心问题之一。巨噬细胞能与多种细胞相互作用进一步影响RA的发生发展。在RA的炎性滑膜中,巨噬细胞能够招募CD4+T细胞大量炎性部位浸润,影响CD4+T细胞向Th1/Th2/Th17/Treg亚型的分化,发挥Th1/Th17细胞的促炎作用或者Th2/Treg细胞的抗炎作用。在CD4+T细胞的激活、扩增、迁移与分化过程中,巨噬细胞也发挥了重要的作用。在RA患者中,骨和软骨破坏是疾病进展导致的结果,所以保护软骨细胞成为了 RA治疗中的一个重点。巨噬细胞的不同亚型对软骨细胞具有不同的作用,M1型巨噬细胞抑制软骨细胞的功能,不利于软骨合成,而M2型巨噬细胞能够强化软骨细胞的功能。此外,成纤维样滑膜细胞（FLS）是滑膜组织中固有细胞,随着炎性疾病的发生,FLS开始表现出异常功能从而加重RA的发展。巨噬细胞影响FLS功能变化,包括FLS分泌基质金属蛋白酶和炎症因子的能力以及侵袭能力,甚至影响FLS介导的软骨降解。可见巨噬细胞对CD4+T细胞、软骨细胞和FLS存在调节作用。CCR2是G蛋白偶联的跨膜受体,是趋化因子CCL2的特异性受体,主要在单核/巨噬细胞上高表达,具有促炎作用。单核细胞通过CCR2特异性识别和结合CCL2,诱导单核细胞向炎症部位聚集。在多种疾病模型中,靶向抑制CCR2有利于改善疾病的进展,包括肺癌、乳腺癌、肾脏损伤、炎症和纤维化和过敏性鼻炎。但是目前的动物实验和临床实验表明CCR2中和抗体或者抑制剂并没有表现出预期的良好效果,对于靶向抑制CCR2治疗RA的作用还需要进一步研究。本课题以巨噬细胞为靶细胞,研究CCR2对巨噬细胞极化作用的影响以及CCR2介导的巨噬细胞对CD4+T细胞、软骨细胞和FLS的调控作用。同时构建CIA模型,研究CCR2抑制剂INCB3344灌胃给药对CIA小鼠的治疗作用,为RA发病机制的研究及寻找新的治疗策略提供实验基础。目的:利用CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞,研究CCR2在巨噬细胞极化过程中的影响,揭示CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞和siRNA介导的CCR2低表达的巨噬细胞系THP-1-M,对CD4+T细胞、软骨细胞和FLS功能的影响,初步从细胞角度说明CCR2巨噬细胞极化,同时靶向抑制CCR2+巨噬细胞调控CD4+T细胞、软骨细胞FLS对改善RA的细胞机制。构建小鼠CIA模型,明确CCR2抑制剂INCB3344给药后对CIA小鼠的治疗作用。方法:1.为了研究CCR2在RA患者滑膜组织和滑膜巨噬细胞的表达情况,利用Western blot检测RA患者滑膜组织中CCR2的表达,免疫荧光检测CCR2在RA患者关节滑膜巨噬细胞中的定位。2.为了研究CCR2对小鼠腹腔巨噬细胞极化功能的影响,分离WT/CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞。流式细胞术检测WT/CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞两组中,LPS/IFNγ-M1型巨噬细胞和IL4-M2型巨噬细胞的比例变化,及巨噬细胞中M1/M2型比值的改变。同时利用qRT-PCR检测WT和CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞给予LPS/IFNγ刺激后iNOS/IL1β/IL6的表达情况。3.为了研究CCR2+巨噬细胞对CD4+T细胞、软骨细胞和FLS细胞行为的影响,通过流式细胞分选技术分选CD4+T细胞并常规培养RA患者FLS和小鼠膝关节软骨细胞。利用transwell共培养小室（0.4μm孔径）,将WT/CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞分别与CD4+T细胞和软骨细胞共培养。利用siRNA构建CCR2敲低巨噬细胞THP-1-M,与RA-FLS共培养。流式细胞术检测WT/CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞与CD4+T细胞共培养后CD4+T细胞向Th1/Th2/Th17/Treg细胞分化的情况并利用transwell小室（8μm孔径）检测CD4+T细胞的趋化迁移能力。WT/CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞与软骨细胞共培养后,CCK 8检测软骨细胞的细胞活力,qRT-PCR检测软骨细胞表达损伤因子（基质金属蛋白酶MMP3/MMP9/MMP13及admast4）和保护因子（Acan 及 Col2a）的情况。THP-1-M 转染 NC/CCR2 siRNA后与RA-FLS共培养,CCK8和transwell（8μm孔径）检测RA-FLS的细胞增殖能力和迁移能力,qRT-PCR检测RA-FLS表达炎性因子IL1β/IL6和MMP1/MMP3/MMP9 的能力。4.为了研究CCR2抑制剂INCB3344对小鼠CIA模型的治疗作用,利用鸡Ⅱ型胶原构建小鼠CIA模型,设立正常组、CIA模型组、CIA+CCR2抑制剂INCB3344组和CIA+MTX组,INCB3344和MTX采用灌胃给药。观察每组小鼠整体指标的改变,包括体重、关节炎指数和关节肿胀数。X射线技术观察小鼠关节变形和软骨损伤,超声观察小鼠关节滑膜中血流信号的改变,H＆E染色观察关节病理改变。流式细胞检测各组小鼠的腹腔巨噬细胞M1/M2型比例的改变。结果:1.CCR2在RA患者滑膜组织中的表达情况Western blot结果表明,与OA患者相比,RA患者滑膜组织中CCR2呈高表达。免疫荧光结果表明,与OA患者滑膜巨噬细胞相比,RA患者滑膜巨噬细胞上CCR2表达显著增加。2.CCR2对小鼠腹腔巨噬细胞极化的影响分别利用LPS/IFNγ或IL4诱导M0巨噬细胞极化成M1型和M2型巨噬细胞。流式结果显示,与WT小鼠巨噬细胞相比,CCR2敲除M1型巨噬细胞比例显著降低,M1/M2型比值也显著降低。qRT-PCR结果表明,与WT小鼠相比,CCR2敲除M1型巨噬细胞中iNOS、IL1β和IL6表达降低。3.CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞对CD4+T细胞功能的影响CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞与CD4+T细胞间接共培养。Transwell（8μm孔径）迁移实验显示,CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞抑制CD4+T细胞的迁移能力。流式细胞术结果表明,与WT小鼠的腹腔巨噬细胞相比,CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞提高了 IL4和Foxp3的水平,降低了 IFNγ和IL17的水平,提示CCR2-/-小鼠的巨噬细胞能够促进CD4+T细胞向抑炎表型发展。4.CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞对软骨细胞功能的影响CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞与软骨细胞间接共培养。CCK8结果显示,CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞促进软骨细胞的细胞活力。qRT-PCR结果也显示,CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞抑制软骨细胞表达损伤因子MMP3/MMP9/MMP1 3/admast4,促进保护因子Acan和Col2a的表达水平,表明CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞能够保护软骨细胞,减少软骨细胞的损伤。5.转染CCR2 siRNA的THP-1-M对RA-FLS功能的影响转染 CCR2 siRNA 的 THP-1-M 与 RA-FLS 间接共培养。Transwell（8μm 孔径）迁移实验结果和CCK8结果显示,与NC相比,转染CCR2 siRNA的巨噬细胞减弱了 RA-FLS迁移能力和细胞活力。转染CCR2 siRNA的巨噬细胞同样能减少RA-FLS表达炎性因子IL6和基质金属蛋白酶MMP3/MMP9。6.CCR2抑制剂INCB3344对小鼠CIA模型的治疗作用与CIA模型组相比,INCB3344给药后,小鼠的体重有逐渐恢复的趋势,减轻小鼠关节炎指数和关节肿胀数,表明INCB3344对小鼠的整体指标有明显的治疗作用。INCB3344可以减轻CIA小鼠膝关节损伤、软骨破坏以及指关节弯曲的表现,还能抑制CIA小鼠膝关节滑膜组织中新生血管的形成。流式细胞术检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中M1/M2型巨噬细胞的表达,结果表明CD11b+CD86+M1型巨噬细胞和CD11b+CD206+M2型巨噬细胞的比值显著降低,提示INCB3344促进巨噬细胞向抑炎表型极化。结论:1.CCR2在RA患者滑膜组织和滑膜巨噬细胞中高表达。CCR2的敲除可以减少腹腔巨噬细胞向M1型极化,使M1/M2型比值降低。CCR2参与巨噬细胞极化,改变M1/M2型的动态平衡。2.CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞减弱了 CD4+T细胞的趋化能力,减少CD4+T细胞向Th1/Th17细胞分化,同时促进Th2/Treg细胞分化,提示CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞能够减少CD4+T细胞浸润,影响CD4+T细胞亚群比例的变化。CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞促进软骨细胞的细胞活力,促进保护因子表达,同时减少损伤因子的表达,提示CCR2-/-小鼠的腹腔巨噬细胞能够保护软骨细胞。转染CCR2 siRNA的巨噬细胞能减弱RA-FLS增殖、迁移能力、炎性因子和基质金属蛋白酶的表达,提示转染CCR2 siRNA的巨噬细胞能够减轻RA-FLS的异常功能。3.CCR2抑制剂INCB3344使腹腔巨噬细胞M1/M2比值降低,提示INCB3344能介导巨噬细胞极化,缓解CIA小鼠的关节炎炎症表现和病理改变。