论文部分内容阅读
目的:为了寻找新的血吸虫免疫诊断候选抗原分子,制备了日本血吸虫成虫分泌代谢抗原(excreted and metabolic antigens of Schistosoma japonicum,Sj-EMAs),对其抗原组分、免疫原性以及免疫反应性进行了初步分析。同时用该成虫分泌代谢抗原免疫小鼠,制备了单克隆抗体,并对此单抗的抗体亚型、在成虫的定位以及western-blot对其进行免疫学特性分析,拟进一步研究该单克隆抗体用于血吸虫病人血清循环抗原检测的应用价值。方法:用日本血吸虫尾蚴(约2000条/兔)感染家兔,42d后处死家兔,门静脉灌注获得日本血吸虫成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5％CO2孵箱37℃培养4h,取上清得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western-Blotting分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗(本室保存的杂交瘤细胞上清)发生反应的蛋白条带。另外,还用Sj-EMAs蛋白免疫小鼠6周后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行杂交融合,HAT筛选出杂交瘤细胞,经亚克隆及扩大培养,建立能稳定分泌抗Sj-EMAs单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并用BALB/c雌性小鼠制备单抗腹水,饱和硫酸铵粗提纯后用Protein G亲和层析柱纯化此腹水。采用Sigma抗体亚型检测试剂盒测定单克隆抗体的Ig类别和亚型。用血吸虫成虫冰冻切片以抗Sj-EMAs蛋白单克隆抗体的小鼠腹水作为一抗行间接免疫荧光实验观察2株单克隆抗体在日本血吸虫成虫的识别位点。用Sj-EMAs上样做SDS-PAGE,以抗Sj-EMAs蛋白单克隆抗体的小鼠腹水作为一抗做Western-Blotting实验以鉴定其免疫学特性。结果:成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1:16000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1:800,1:400,1:800和1:100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白主要条带,分子量分别是13、40、60和180kd左右;Western blot表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5kd左右处识别。获得两株特异性分泌抗Sj-EMAs单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经过体外多次传代培养后,仍能分泌高效价的抗体,用BALB/c小鼠制备单抗腹水经纯化后也有较高的效价。两株杂交瘤细胞的抗体亚型均为 IgG1。免疫荧光实验结果显示两株杂交瘤细胞抗体的识别位点在日本血吸虫成虫的体被表膜上。Western-Blotting证实两株细胞均为分泌抗Sj-EMAs单克隆抗体的杂交瘤细胞,均识别25kd左右的分泌代谢抗原。结论:本研究获得了日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,证实了该抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性。同时获得2株特异性分泌抗Sj-EMAs单克隆抗体的细胞株。且细胞上清和腹水中单克隆抗体的效价均较高。两株单抗亚型均为IgG1。Western-Blotting结果证实了该2株单克隆抗体的免疫学特性,免疫荧光实验结果证实两株杂交瘤细胞抗体的识别位点位于日本血吸虫成虫的体被表膜上。