论文部分内容阅读
目的 (1)建立结核杆菌抗原(Mtb-Ag)再刺激活化的人γδT细胞凋亡模型；(2)观察不同浓度乙醇和二甲基亚砜(DMSO)致γδT细胞和αβT细胞凋亡及对细胞活性的影响：(3)探讨神经酰胺(C2-Cer)诱导γδT细胞和αβT细胞凋亡作用的不同之处；(4)应用信号分子阻断剂观察PI3K，MAPK和PKC等信号传导途径在Mtb-Ag再刺激诱导γδT细胞凋亡中的作用。 方法 (1)正常人外周血单个核细胞分别用Mtb-Ag和CD3单抗(CD3mAb)刺激并加IL-2培养扩增，分别获得Mtb-Ag激活的T细胞(MtbAT)(γδT细胞为主)和CD3mAb激活的T细胞(CD3AT)(αβT细胞为主)。(2)培养15d～25d的MtbAT用3种浓度Mtb-Ag分别再刺激24h后，应用Annexin-V-FITC／PI染色流式细胞术(FCM)检测γδT细胞凋亡。(3)MtbAT用Mtb-Ag(10.0μg／ml)分别再刺激3h、6h、12h、24h后，检测γδT细胞凋亡情况。(4)用4种浓度乙醇和DMSO分别作用于MtbAT和CD3AT 4h、24h后，应用Annexin-V-FITC／PI染色FCM检测γδT细胞和αβT细胞凋亡，应用MTT比色法分析两类T细胞活性。(5)用4种浓度C2-Cer分别作用于MtbAT和CD3AT 3h后，检测γδT细胞和αβT细胞凋亡及细胞活性。(6)MtbAT预先用LY294002(P13K途径抑制剂)、SB203580(p38途径抑制剂)、Rottlerin(PKC抑制剂)分别处理60min，然后用Mtb-Ag(10.0μg／ml)再刺激3h后，检测γδT细胞凋亡。 结果 (1)MtbAT中γδT细胞比例可达70％～90％，CD3AT中αβT细胞比例＞90％。(2)与对照组相比，5.0μg／ml MtbAg诱导γδT细胞凋亡不显著(P＞0.05)，凋亡安徽医科大学硕士学位论文细胞比例仅增加8.05%;10.0协留ml和20.0协岁ml MtbAg均显著诱一导协T细胞凋亡 (P<o.ol)，凋亡细胞比例分别增加35.63%及38.83%，且此二种浓度MtbAg在诱导协T细胞凋亡方面无显著性差异(P>0.05)。‘3)与对照组相比，’10.0林留mlMth一Ag再刺激MthAT3h、6h、12h、24h均可显著诱导协T细胞凋亡(P<0 .01)，凋亡细胞比例在44.21%一51 .76%之间;10.0卜留ml Mtb一Ag再刺激MthAT3h实验组与再刺激MtbAT 24h实验组相比，在诱导协T细胞凋亡方面无显著性差异 (P>0.05)，后者的凋亡细胞比例仅比前者增加7.55%。(4)与对照组相比，除浓度为1.0%及2.0%DMSO作用于apT细胞24h诱导其凋亡显著(P<0.05)及浓度为2.0%DMSO作用于apT细胞4h对细胞活性抑制显著(P<0 .05)外，低浓度乙醇及DMsO(三2.0%)诱导协T细胞和。pT细胞凋亡及抑制其细胞活性作用均不显著(P>0.05);与对照组相比，除5.0%乙醇作用于apT细胞4h及5.0%DMSO作用于协T细胞4h诱导细胞凋亡不显著(P>0.05)外，高浓度乙醇和DMSO(5 .0%)诱导协T细胞和apT细胞凋亡及抑制二者细胞活性作用均显著增加(P<0 .05)。(5)与对照组比较，低浓度CZ一cer(毛10 0 mol/L)诱导协T细胞和apT细胞凋亡及抑制其细胞活性作用均不显著(P>0.05);高浓度cZ一Cer诱导泌T细胞和apT细胞凋亡及抑制其细胞活性作用均存在显著差异(P<0.05)，100协mol/L的CZ一Cer诱导协T细胞、仪pT细胞凋亡比例分别增加104%、P>。.必;及73.5%(P<0.01)，活细胞区(Rl区)的细胞比例分别为对照组的88.1%(P>.05)和7.8%(P<0.01);而500 p mol几时诱导协T细胞和a日T细胞凋亡比例分别增加71.9%和73.8% (P<0 .01)，Rl区的细胞比例分别为对照组的36.5%和2.7%(P<0 .01)。(6)Mtb一Ag再刺激Mtb灯诱导丫6T细胞凋亡可分别被sBZo35so(50.0林mol/L)和Rortlerin(40.0林mof几)几乎完全抑制，凋亡抑制率分别为916%及98.6%;而LY294002(10.0林mol/L)可部分抑制Mth一Ag再刺激诱导的协T细胞凋亡，凋亡抑制率为43.1%。结论(l)通过用较高浓度Mth一Ag(10.0林留ml)再刺激活化的Y6T细胞3h后，可建立Mth一Ag再刺激活化的人Y6T细胞凋亡模型。(2)高浓度乙醇和DMsO(5 .0%)对协T细胞和apT细胞均有诱导凋亡作用，且对二者活性均有抑制作用。 3安徽医科大学硕士学位论文(3)C2一Cer能诱导声i细胞和。pT细胞发生凋亡，诱导协T细胞发生凋亡所需CZ一Cer浓度明显高于诱导apT细胞所需浓度。(4)信号分子阻断剂的实验证明，MAPK途径的P38通路，PI3K途径和PKC均参与了Mtb一Ag再刺激己活化协T细胞凋亡过程。