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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）感染家猪或野猪引起的一种高度接触性传染病,给全世界生猪养殖业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将猪瘟列为必须报告的动物传染病,我国也将其列为一类动物疫病。尽管疫苗免疫接种和病猪扑杀及无害化处理等措施在我国猪瘟防控中发挥了重要作用,但隐性感染和持续性感染现象仍比较严重,制约着我国生猪养殖业的健康发展。病毒的有效感染是引发疫病的基础,病毒只有进入到细胞内增殖位点并组装复制相关原件,才能建立感染进而引发疫病。细胞内囊泡转运系统在病毒入侵、组装和释放等多个环节发挥重要功能,发现和揭示这些囊泡转运系统与CSFV增殖的关系是阐明CSFV致病机理的基础。因此,本文以永生化猪脐静脉血管内皮细胞系（SUVECs,简称猪血管内皮细胞）为细胞模型,围绕外被体蛋白Ⅰ（coat protein complexesⅠ,COPⅠ）包被囊泡依赖型高尔基体-内质网（Golgi-ER）逆向转运途径和Rab18蛋白介导的非COPⅠ包被囊泡依赖型Golgi-ER逆向转运途径对CSFV转运与增殖的影响及其作用机理开展研究,获得以下结果。1.COPⅠ包被囊泡参与CSFV胞内转运与增殖（1）激光共聚焦试验显示COPⅠ包被囊泡与CSFV E2蛋白、C蛋白存在明显共定位,表明COPⅠ包被囊泡具有转运CSFV的作用。（2）针对COPⅠα和ε亚基建立敲除细胞系,RT-q PCR和激光共聚焦试验表明敲除COPⅠ显著（P<0.05,下同）抑制CSFV的入胞,证明COPⅠ包被囊泡参与CSFV入胞过程中的转运。（3）激光共聚焦试验显示CSFV在入胞早期阶段与Rab5和Rab7存在明显共定位,并发现干扰Rab5和Rab7显著抑制CSFV增殖,表明CSFV依赖早期内体（early endosome,EE）和晚期内体（late endosome,LE）途径入胞。利用布雷菲德菌素A（Brefeldin A,BFA）和杀真菌剂A（Golgicide A,GCA）破坏COPⅠ包被囊泡功能,发现BFA和GCA能够阻止CSFV与Rab7的共定位,揭示了COPⅠ包被囊泡通过晚期内体途径转运CSFV,参与CSFV入胞的机制。（4）利用抑制剂或基因敲除手段破坏COPⅠ包被囊泡功能可以显著抑制CSFV的增殖;反之,CSFV感染能够显著促进COPⅠm RNA的表达,并破坏COPⅠ包被囊泡的胞内定位。2.COPⅠ包被囊泡调控蛋白Rab1b参与CSFV增殖（1）用重组慢病毒包装系统建立Rab1b敲低细胞系,发现敲低Rab1b极显著（P<0.01或P<0.001,下同）抑制CSFV增殖。构建Rab1b失活突变体（Rab1b-N121I）,并转染细胞,发现Rab1b-N121I能够显著抑制CSFV增殖。（2）激光共聚焦观察Golgi结构,并检测细胞上清中荧光素酶含量,证明CSFV感染破坏细胞Golgi结构和分泌功能。3.ARF1以GBF1-Sec7结构域依赖性调节线粒体胆固醇转运参与CSFV增殖（1）用重组慢病毒包装系统建立高尔基体特异性BFA抗性因子1（GBF1）敲低细胞系,发现敲低GBF1极显著抑制CSFV增殖。通过构建GBF1截短突变体,用RTq PCR和IFA检测各突变体对CSFV增殖的影响,发现GBF1 Sec7结构域是GBF1参与CSFV增殖的关键结构域。（2）通过si RNA筛选GBF1 Sec7结构域下游效应因子ADP-核糖基化因子（ARFs）家族对CSFV增殖的影响,发现干扰ARF1、ARF2、ARF3、ARF4和ARF5均可以极显著抑制CSFV增殖,并发现ARF1以Sec7结构域依赖的形式,通过调控线粒体胆固醇转运促进CSFV的增殖。（3）发现CSFV感染显著促进ARFs成员m RNA表达,但不影响胞内定位。4.Rab18蛋白通过与NS5A的互作参与CSFV RNA复制、组装与增殖（1）用重组慢病毒包装系统建立Rab18敲低细胞系,证明Rab18参与猪瘟病毒RNA复制和子代病毒粒子的组装。（2）联合免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down和激光共聚焦试验,发现不同状态下的Rab18蛋白通过互作关系调控CSFV NS5A蛋白的胞内转运,揭示了Rab18蛋白调控猪瘟病毒RNA复制和子代病毒粒子组装的机制。（3）调控Rab18表达,发现过表达Rab18或激活突变体（Rab18-Q67L）显著促进CSFV增殖,敲低Rab18或过表达失活突变体（Rab18-S22N）显著抑制CSFV增殖,证明Rab18正向调控CSFV增殖。综上所述,本研究表明COPⅠ包被囊泡及其调控蛋白Rab1b、GBF1、ARFs参与CSFV增殖,其中COPⅠ包被囊泡通过晚期内体途径转运CSFV,并参与CSFV的入胞过程;关键调控蛋白ARF1以GBF1 Sec7结构域依赖的形式通过调节线粒体胆固醇转运促进猪瘟病毒增殖;证明COPⅠ包被囊泡依赖型Golgi-ER逆向转运途径是CSFV增殖的重要宿主因子。Rab18蛋白通过互作关系调节CSFV NS5A蛋白的胞内转运,进而参与CSFV RNA复制、子代病毒粒子组装和增殖;证明Rab18蛋白介导的非COPⅠ包被囊泡依赖型Golgi-ER逆向转运途径是CSFV增殖的重要宿主因子。研究结果为阐明Golgi-ER逆向转运途径在CSFV增殖中的作用及机制提供了新的科学依据。