梅林青霉对纤维素降解特性及机制的研究

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微生物降解是目前利用纤维素最有前途和最为理想的方法,由于菌株降解纤维素活力有限;降解机制研究中菌株模式化等问题的阻碍,微生物降解利用纤维素相对有限。筛选活力较高的纤维素降解菌株并对其降解纤维素机制研究,对于解决目前面临的环境和能源危机具有重要的理论与实践意义。  本文中预试验采集的35个降解纤维素样本经刚果红纤维素粉琼脂分离纯化,得到69个纤维素降解菌株,用滤纸条培养基筛选得到菌株16株,再经过以羧甲基纤维素钠(CMC)和麦麸为主的发酵培养基筛选,筛选得到纤维素酶活力较高的菌株5株,其中较高活性Z18菌株经鉴定为梅林青霉(PenicilliummeliniiThom),关于其降解纤维素文献未见报道,本文针对关于梅林青霉Z18菌株降解纤维素未知领域进行研究。  采用逐步优化方法研究不同培养条件对梅林青霉生产纤维素酶的影响。发酵比较发现:碳源中麦麸诱导效果好于稻草、玉米秸、羊草;氮源发酵比较发现,尿素明显降低β-葡萄糖苷酶活力。28℃和pH5.0是产纤维素酶最佳温度与酸碱度,当培养11d时各项酶活力达到最大值。溶氧量的增加提高羧甲基纤维素钠酶和β-葡萄糖苷酶的活力,剪切力增加使滤纸酶活性降低。研究纤维素酶特性发现,纤维素的底物浓度影响降解效率,纤维素浓度高于5%时,产生明显底物抑制。50-60℃和pH5.5是纤维素酶解的最佳温度和酸碱度。  以Sigmacelltype50作为纤维素底物研究纤维素酶降解机制,发现外切葡聚糖酶对热的稳定性较低,在45℃保温12d时,其活力下降到原活力的53.71%;而在降解纤维素12d时,其活力下降到原活力的20.94%,它在纤维素降解过程中呈现活力快速下降的趋势导致降低纤维素降解效率。纤维素经酶连续与反复处理的X衍射和红外光谱分析表明:纤维素降解初期无定形区的水解能力要大于对结晶区的水解能力,纤维素长期酶解过程中,纤维素的结晶度总体呈现下降趋势,纤维素无序化造成外切葡聚糖酶吸附的困难,纤维素的超分子结构发生了变化,存在由Ⅰ型向Ⅱ型转变趋势,而纤维素超分子结构没有显示由α型向β型转变趋势,纤维素分子内和分子间氢键增加。  采用通常使用测定羟基自由基(HO˙)的TBA反应,经过对多种指标的检测,发现梅林青霉能够产生HO˙,对超滤液处理后的纤维素采用X射线衍射测定和红外光谱检测,随着处理时间的延长,纤维素的结晶度和红外结晶系数明显降低,同时红外光谱检测纤维素的葡萄糖单体上的部分羟基氧化为羧基,揭示梅林真菌降解纤维素存在氧化机制。氧化性预处理并没有提高纤维素材料的可酶解性,红外光谱分析显示,Fenton试剂预处理使纤维素材料的结晶度下降,但也使纤维素材料增加过多还原性末端,说明梅林青霉降解纤维素产生HO˙途径远比Fenton反应复杂。  采用瑞典BioengineeringNLF19L生物反应器发酵后得到的粗酶液,经(NH4)2SO4分级沉淀、SephadexG-100分子筛层析和DEAESephadexA-50离子交换层析等步骤,分离得到一种β-葡萄糖苷酶和两种内切葡聚糖酶,对纯化β-葡萄糖苷酶的特性进行研究,结果表明:β-葡萄糖苷酶组分的分子量分别为129kD,最适反应温度是60℃,最适反应pH6.0,60℃以下稳定,动力学常数Vm显示,其具有很强催化β-葡萄糖苷键的水解能力,因而具有良好的研究与应用前景。  内切葡聚糖酶Ⅰ分子量为29kD,最适和的反应温度和最适反应pH值分别是40℃、3.5,是一种耐酸性很强、对反应的温度要求较低的纤维素酶,由于在纤维素酶中比例较大和对滤纸有显著的降解作用,因此推断它是降解纤维素的主要组分。动力学常数Vm显示,其具有很高内切葡聚糖能力,因而在纸张改性等方面具有良好的研究与应用价值。内切葡聚糖酶Ⅱ分子量为38kD,最适反应温度和pH是60℃,6.0。动力学常数Vm显示,虽然没有很高内切葡聚糖能力,但该酶具有很高的木聚糖酶活性,因此在多糖化学领域应用有重要前景。  通过以上研究为梅林青霉应用奠定基础;为纤维二糖水解酶作为今后分子定向改造的重点提供很好的启示;揭示梅林青霉纤维素酶水解和氧化降解纤维素的部分机制;因此本文对于高效利用纤维素资源具有重要的理论和实践意义。
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