研究背景湿疹是常见的变态反应性皮肤病,有剧烈瘙痒、多形性皮疹、渗出倾向的特点,较为难治,缠绵不愈。由于皮肤损容,瘙痒剧烈,患者的心理、穿衣、社交娱乐、工作学习及治疗等方面造成了不同程度的影响,严重影响患者的生活质量。国内外研究都指出,湿疹患者在心理科90项症状评分中躯体化、人际关系、恐怖、抑郁、焦虑、偏执等因子的评分差异有统计学意义,并且剧烈的瘙痒和抑郁、焦虑情绪严重影响患者的睡眠。我国2011年湿疹诊疗指南指出：湿疹是由多种内外因素引起的一种具有明显渗出倾向的炎症性皮肤病,伴有明显瘙痒,易复发。湿疹的临床分为急性期、亚急性期及慢性期。急性期表现为红斑、水肿基础上出现粟粒大丘疹、丘疱疹、水疱、糜烂及渗出,病变由中心向外周蔓延。亚急性期红肿和渗出减轻,糜烂面结痂、脱屑。慢性湿疹表现为粗糙肥厚、苔藓样变伴发甲改变和色素改变,自觉瘙痒,甚至剧痒。目前外用糖皮质激素制剂依然是治疗湿疹的主要药物,糖皮质激素制剂能有效缓解症状,但湿疹本身容易反复发作,长期使用糖皮质激素会导致皮肤萎缩,毛细血管扩张,色素沉着,有时出现继发感染。外用钙调神经磷酸酶抑制剂(如他克莫司软膏)是新型治疗湿疹药物,作用与糖皮质激素作用类似,没有类似糖皮质激素的副作用,但价格昂贵,疗效有待进一步临床数据支持。中医药外用治疗湿疹源远流长,疗效可靠。祖国医学对湿疹的记载分散于“疮”、“湿疮”、“癣”、“风”等病名中,认为湿疹发病多先天因禀赋不足,外受风热湿邪,又过食肥甘辛辣,脾胃内伤,湿从内生,湿邪蕴久化热,内外之邪相搏,充于肌肤腠理而发病,其发病与心、脾、肝功能失常关系密切。中药适应症广,副作用少,耐药性低,综合疗效突出。苦桉祛疹凝胶由大叶桉、蛇床子、苦参、广东紫荆皮、广藿香组成。研究表明,大叶桉外用治疗烧伤、蜂窝组织炎、乳腺炎、湿疹、脚癣,大叶桉不同溶剂提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌和绿色木霉菌、青霉菌等真菌均具有不同程度的抑制作用。广藿香体外对白色念珠球菌、新型隐球菌等真菌有明显抑制作用,具有一定抗氧化能力。苦参用于热痢,便血,黄疸尿闭,赤白带下,阴肿阴痒,湿疹,疮,皮肤瘙痒,疥癣麻风,苦参碱具有体外抗真菌活性。广东紫荆皮外用治皮肤瘙痒,湿疹。湿疹发病过程中,炎症因子发挥重要作用。Thl/Th2细胞分化失衡引起细胞因子分泌异常是湿疹的发病机制之一,Thl细胞主要分泌IFN-y,Th2细胞主要分泌IL-4,实验上可以通过检查IFN-γ、IL-4水平以反映Thl/Th2细胞分化。湿疹表现为Th2细胞优势应答,IL-4升高,引起内皮细胞黏附分子表达上调,趋化白细胞聚集产生炎症。白三烯类物质是湿疹发病过程中重要的炎症介质,其作用于半胱氨酰白三烯受体,引起多种变态反应的发生。研究表明湿疹患者外周血中LTB4、LTC4水平升高,皮肤组织中白三烯受体CysLTR1、CysLTR2升高。LTs作用于受体,具有白细胞趋化作用,引起皮肤炎症,表现出皮肤红斑、肿胀、渗出,引起的皮损表现,LTs还具有增加毛细血管通透性的作用,微血管处血浆渗出形成水肿,表现出皮肤肿胀、渗出。IL-17和IL-31是近年发现的与湿疹相关的炎症因子,研究发现湿疹患者和动物模型中IL-17都升高,IL-17作为早期细胞因子诱导免疫细胞释放促炎症因子。IL-31作用于受体后,诱导表皮角质细胞产生炎症因子,使皮肤产生炎症反应,引起湿疹样皮损,而且与瘙痒密切相关。课题组在多年从事皮肤临床研究基础上,结合南方地区湿热气候下皮肤病的发病规律和特点,组方“消疹止痒膏”,处方由大叶桉、蛇床子、苦参、广东紫荆皮、广藿香组成,用于治疗湿疹、皮炎、癣等,对急性湿疹、亚急性湿疹、慢性湿疹、神经性皮炎、特应性皮炎有效。在前期的研究基础上,以“消疹止痒膏”为基础,提取有效部位,开发出“苦桉祛疹凝胶”,在药效学上已证实其具有体外抑菌、抗过敏、止痒作用。本研究探讨苦桉祛疹凝胶的抗炎作用及对湿疹模型的作用,着重探讨其对IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-31、LTB4、LTC4的影响,以及对CysLTR1和CysLTR2蛋白的作用,明确其作用机制。研究目的1.通过研究苦桉祛疹凝胶对大鼠足肿胀模型、小鼠耳肿胀模型、小鼠皮肤毛细血管通透性增加模型的作用,探讨苦桉祛疹凝胶的抗炎作用。2.研究苦桉祛疹凝胶对二硝基氯苯诱导大鼠湿疹模型的影响,并探讨其机制,为苦桉祛疹凝胶的进一步开发利用奠定实验基础。方法1实验药物苦桉祛疹凝胶,凝胶基质,皮炎平,冰黄肤乐软膏。2实验动物昆明种小鼠120只,雌雄各半。SD大鼠100只,雌雄各半。3苦桉祛疹凝胶抗炎作用研究3.1大鼠足肿胀实验60只大鼠随机分为模型组、凝胶基质组、皮炎平组、苦桉祛疹凝胶低剂量组、苦桉祛疹凝胶中剂量组、苦桉祛疹凝胶高剂量组。于大鼠右后足背涂药7 d。用药后于右后足皮下注射角叉菜胶,测量注射前后足容积。以右后足注射角叉菜胶前后容积之差,作为足肿胀程度。3.2小鼠耳肿胀实验60只小鼠随机分为模型组、凝胶基质组、冰黄肤乐软膏组、苦桉祛疹凝胶低剂量组、苦桉祛疹凝胶中剂量组、苦桉祛疹凝胶高剂量组。于小鼠右耳廓涂药7 d。用药后于右耳滴二甲苯溶液,用打孔器分别在左、右耳廓相似位置打下圆耳片并称重量。左右耳质量差为肿胀度。制作病理切片。3.3小鼠皮肤毛细血管通透性增加实验60只小鼠随机分为模型组、凝胶基质组、冰黄肤乐软膏组、苦桉祛疹凝胶低剂量组、苦桉祛疹凝胶中剂量组、苦桉祛疹凝胶高剂量组。于小鼠背部皮肤涂药7 d,用药后尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水,背部皮肤涂二甲苯,剪下涂药处皮肤,放入丙酮-水(7：3)内浸泡,并于分光光度计590nm波长处比色,测量吸光度。4苦桉祛疹凝胶对大鼠湿疹模型皮损的影响40只SD大鼠随机分为正常组、湿疹模型组、阳性对照组,苦桉祛疹凝胶组。于大鼠背部皮肤用二硝基氯苯丙酮溶液致敏、激发制作湿疹模型后用药,记录皮损情况并评分,取皮肤制作病理切片。5苦桉祛疹凝胶对湿疹相关炎症因子及CysLTRl和CysLTR2的影响。取血清检测IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-31、LTB4、LTC4水平。免疫组化法和Westernblot法检测皮损处皮肤CysLTR1和CysLTR2的表达。6统计分析用X±S进行统计描述,采用单因素方差分析,多重比较采用LSD法,P<0.05有统计学意义。结果1.与模型组比较,凝胶基质组、皮炎平软膏组、苦桉祛疹凝胶低、中、高剂量组的足肿胀在1 h、2 h、3 h、4 h均减轻(P<0.01)。低、中、高剂量组两两比较,足肿胀无统计学差异(P>0.05)。2.与模型组比较,凝胶基质组、冰黄肤乐软膏组耳肿胀度无统计学差异(P>0.05),苦桉祛疹凝胶低、中、高剂量组耳肿胀(P<0.05)减轻。低、中、高剂量组两两比较,耳肿胀度无统计学差异(P>0.05)。病理切片可见苦桉祛疹凝胶各组耳廓中炎症细胞浸润、细胞间水肿减轻。3.与模型组比较,凝胶基质组、冰黄肤乐软膏组吸光度无统计学差异(P>0.05),而苦桉祛疹凝胶低、中、高剂量组吸光度均下降(P<0.05)。低、中、高剂量组两两比较,吸光度无统计学差异(P>0.05)。4.与湿疹模型组比较,苦桉祛疹凝胶组皮损评分在第6 d、8 d、9 d减少(P<0.05),表现红斑、丘疹、抓痕/剥脱均减轻,阳性对照组皮损评分在用药第6d下降(P<0.05)。5.病理切片可见湿疹模型组呈角化过度、角化不全、颗粒层肥厚、棘层肥厚。苦桉祛疹凝胶组和阳性对照组的上述病理改变减轻。6.各组血清中IFN-γ水平无统计学差异(P>0.05)。与正常组比较,湿疹模型组IL-4水平升高(P<0.05)。与湿疹模型组比较,苦桉祛疹凝胶组和阳性对照组IL-4水平都下降(P<0.05)。7.与正常组比较,湿疹模型组IL-17、IL-31、LTB4、LTC4水平都升高(P<0.05)。与湿疹模型组比较,苦桉祛疹凝胶组IL-17、IL-31、LTC4水平下降(P<0.05),LTB4水平无统计学差异(P>0.05)。阳性对照组IL-17、IL-31、LTB4、LTC4水平下降(P<0.05)。8.免疫组化法结果：与正常组比较,湿疹模型组CysLTRl和CysLTR2高表达,主要表达于皮肤组织的表皮层和真皮层。与湿疹模型组比较,苦桉祛疹凝胶组和阳性对照组的CysLTR1和CysLTR2表达下调。9.Western blot法结果：与正常组比较,湿疹模型组的CysLTRl呈高表达(P<0.05),CysLTR2高表达(P<0.01)。与湿疹模型组比较,苦桉祛疹凝胶组CysLTR1的表达减弱(P<0.05),CysLTR2表达减弱(P<0.01)。与阳性对照组比较,苦桉祛疹凝胶组CysLTR1、CysLTR2表达无统计学差异(P>0.05)。结论：1.苦桉祛疹凝胶具有抗炎作用。2.苦桉祛疹凝胶对大鼠湿疹模型皮损有改善作用,与下调血清中IL-4、IL-17、IL-31、LTC4水平以及皮肤CysLTR1和CysLTR2的表达有关。