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背景与目的脊髓性肌萎缩症以进行性的肌萎缩和肌无力为主要临床表现,是一种致死性的神经退行性病变,主要病因为运动神经元生存基因1（Survival Motor Neuron 1,SMN1）的纯合缺失。人体内存在与SMN1高度同源的SMN2基因可部分补偿其功能。但因SMN2中个别碱基的差异,导致其产生的多为不含7号外显子的截短型转录本,最终产生功能不全、容易降解的截短型SMN蛋白。所有存活的SMA患者均存在至少1拷贝的SMN2基因。因此,提升SMN2产生全长转录本的能力,使之足以代偿SMN1的功能是SMA基因治疗的重要策略。单碱基编辑是一种由CRISPR/Cas9系统衍生而来的基因编辑技术。通过对Cas9蛋白进行突变并融合脱氨酶,使其可以在sg RNA的引导下实现对特定目标区域内的一个或多个碱基进行定向突变,而不产生DNA的双链断裂。研究者尝试使用腺嘌呤单碱基编辑器,对SMN2 7号外显子引入突变,成功提高了神经元细胞的SMN2全长转录本的比例,从概念上证明了单碱基技术治疗SMA的可行性。然而对外显子区域的编辑难以避免旁观者效应所引起蛋白错义突变,使得成体治疗的安全性无法得到准确评估。因此仍需对基于单碱基编辑的SMA干预方案做进一步的优化和改良。本研究将基于新型的高保真单碱基编辑系统,对HEK-293T细胞及SMA患者来源的诱导多能干细胞的SMN2 7号内含子剪接连接点进行突变,引起7号内含子保留,进而避免7号外显子在剪接过程中的跳跃。并从RNA及蛋白水平,对这一新的策略是否能有效提高7号外显子纳入转录本表达量及全长SMN蛋白的表达进行验证。方法1.设计并构建针对SMN2 7号内含子剪接连接点的腺嘌呤单碱基编辑器（adenine base editor,ABE）及胞嘧啶单碱基编辑器（cytosine base editor,CBE）质粒,转染HEK-293T细胞并通过流式分选富集荧光蛋白强阳性细胞。对富集到的细胞进行Sanger测序及二代测序检测编辑效率,RT-PCR检测SMN2转录本变化情况;针对特定位点,构建点突变SMN2 minigene,转染HEK-293T细胞后,通过反转录-PCR观察mini-SMN2的转录本变化情况。2.免疫荧光染色鉴定SMA患者来源的诱导多能干细胞（SMA-i PSCs）多能性标志物。使用筛选后得到的方案,电穿孔转染SMA-i PSCs,构建编辑后单克隆细胞株,Sanger测序和扩增子测序鉴定基因型和SMN2被编辑拷贝数,RT-PCR与q PCR检测并定量SMN2转录本变化情况,Western blot检测SMN蛋白表达量变化情况。结果1.ABE系统对HEK-293T的SMN2 7号内含子剪接连接点受体位点（-2A）成功进行了A→G突变,突变效率达70%,并产生了包含7号内含子的加长型转录本。2.CBE系统对HEK-293T的SMN2 7号外显子内的52G、53G位点实现了G→A的突变,有效提高了全长SMN2转录本比例;minigene点突变验证结果同样表明G52A、G53A突变能大幅提高全长转录本比例,并且比例高于先前研究中进行的7号外显子A36G突变。3.基于ABE系统成功构建了剪接连接点受体位点A-2G突变的i PS单克隆细胞株,同样产生了包含7号内含子的加长型转录本。所有被编辑的细胞株中包含7号外显子的转录本（即合计加长型转录本与全长转录本）均高于未编辑的SMA-i PSCs,并且大部分细胞株SMN蛋白表达量相较于SMA-i PSCs有所提高。结论1.SMN2 7号内含子剪接连接点受体位点A-2G突变可产生7号内含子保留转录本并提高全长SMN蛋白表达量;基于单碱基编辑技术突变剪接连接点引起SMN2 7号内含子保留可有效提高SMN蛋白总量,该干预策略从原理上可行。2.SMN2 7号外显子G52A、G53A突变能大幅提高全长转录本,这两个位点可作为单碱基编辑实现SMA基因治疗的候选位点。