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持续人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌和一些生殖器瘤样病变的主要原因。HPV有多种基因型,感染生殖道的HPV可分为低危型和高危型。HPV高危型感染与宫颈癌有密切联系,在我国以HPV-16,-18和-52最为常见,其次是HPV-33(?)-58。低危型感染与生殖器瘤样病变有关,在我国最常见的低危型为HPV-6和-11。HPV基因分型对宫颈癌筛查、流行病学调查及疫苗研发策略等具有重要意义。目前常用的HPV基因分型检测试剂方法原理多样,如聚合酶链反应(Ploymerase chain reaction, PCR)-膜上杂交、实时荧光PCR等,这些方法检测敏感性有所不同,并且也可能存在不同基因型的交叉反应。为解决HPV分型检测试剂标准化的问题,英国国家生物学标准品和质控品研究所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)研究建立了HPV-16和-18国际标准物质,试剂生产厂家可使用这些标准物质确定其HPV-16,-18试剂的分析灵敏度、进行量值溯源和制备厂家批间质量控制参考品；临床实验室则可使用这些标准物质对HPV-16和-18检测试剂进行性能验证以及室内质量控制。但国际标准物质价格昂贵,且数量少,不能满足我国试剂标准化、实验室对试剂方法性能评价、室内质量控制和室间质量评价的需要。室间质量评价是HPV分型检测质量保证的重要内容。采用人宫颈癌细胞作为质评样本,分装过程中由于细胞的沉降,使得样本的均匀性和可重复性较差。在本研究之前,我国临床实验室HPV基因分型检测的室间质量评价尚为空白。对试剂方法的分析敏感性、准确性、交叉反应以及临床实验室的检测能力缺乏有效的评估。我们通过从ATCC购买HPV-16(GenBank:K02718)、-18(GenBank:X05015)全长质粒,全长测序验证后,转化提取纯化,260nm波长下确定拟制备参考物质浓度,并根据浓度稀释至约5E+6拷贝数/mL,加入制备的人基因组DNA作为基质,分装后,采用国际通行研究方法,进行均匀性和37℃、室温(20～25℃)、2～8℃和-20℃条件下的稳定性研究,并采用4种实时荧光PCR试剂,通过与国际标准物质HPV-16(NIBSC code:06/202,量值为5×106IU/瓶)和HPV-18(NIBSC code:06/206,量值为5×106IU/瓶)建立定值标准曲线,进行溯源定值,计算不确定度。结果表明,HPV-16和-18参考物质均匀性良好,(-20±5)℃可稳定12个月以上；2～8℃下可稳定3个月；室温下稳定15天；37℃下稳定7天。HPV-16参考物质浓度为(7.1±1.6)x106IU/ml, HPV-18参考物质浓度为(3.5±0.9)×106IU/ml。本研究制备的HPV-16和-18参考物质将申报国家一级标准物质。同样,我们研究制备了HPV-6、-11、-31、-33、-39、-51和-52等(其中-11,-52全长质粒源自ATCC,其他全长质粒源自香港城市大学)7种我国常见HPV基因型质控品,因目前这7种基因型尚无国际标准物质,故定值方法采用纯化质粒在260nm下吸光度值计算得到,单位为GE/mL (genome equivalents/mL)。上述参考物质均通过全长测序和PCR-点杂交法进行验证。并与前述的HPV-16和-18基因型参考物质组建包括上述HPV不同基因型、同一基因型不同浓度、不同基因型混合感染及阴性样本在内的由25份样本组成的室间质量评价样本盘,其中HPV-16和-18浓度分别为106IU/mL、105IU/mL和104IU/mL; HPV-6、-11、-31、-33、-39、-51和-52浓度分别为106GE/mL和105GE/mL;3份混合样本(HPV-6、-51和-16混合,HPV-33、-39和-52混合以及HPV-18和-31混合)和1份阴性样本。将上述样本盘以特快专递常温下邮寄至全国76家开展HPV分型检测的临床实验室,要求实验室按其日常检测临床标本的试剂方法和程序进行检测,并在规定的时间内回报结果。然后将各实验室回报的结果与预期结果相比较,计算结果符合率和实验室能力验证(proficiency test, PT)的成绩,并根据不同试剂进行分组评价。结果表明这些实验室对HPV-16(?)-18106IU/mL浓度的样本的符合率分别为98.7%和96.0%。HPV-6、-31、-33和-52106GE/mL浓度样本的符合率在90%以上,而HPV-51、-11和-39106GE/mL浓度样本的符合率仅为42.7%、55.6%和21.3%。有18个临床实验室报告了假阳性结果,假阳性结果分布在28个样本中。在18个回报假阳性结果的实验室中,4个临床实验室回报了3个假阳性结果。使用PCR-杂交法的临床实验室回报了24例假阳性结果。采用HPV-16和-18全部检测合格,其它基因型最多允许1个假阳性结果的国际通行评价标准,只有9个实验室的结果为100%符合。HPV基因分型室间质量评价结果说明,目前国内临床实验室在HPV基因分型的检测中存在对某些特定基因型如HPV-39、-51以及对混合感染检测能力低的问题,并有较多的假阳性结果,假阳性结果在易出现污染的PCR-点杂交法中出现较多。说明临床实验室需进一步加强试剂方法的性能验证和实验室质量管理,严格操作程序,执行有效的实验室防止扩增产物“污染”的措施。本研究率先在国内研究制备了可溯源至国际标准物质的HPV-16、-18候选国家标准物质,将申报国家一级标准物质,一级标准物质在国内是唯一的。并在研究制备HPV国内常见9种基因型室间质量评价样本盘的基础上,率先在国内开展了HPV基因分型的室间质量评价,有效地发现了国内临床实验室在HPV基因分型检测上存在的检测质量问题,为临床实验室改进日常检验质量提供了方向。