近年来,随着测序深度与蛋白结构解析技术的不断提高,针对恶性肿瘤的相关研究取得了长足的进步。人们逐渐发现,单纯的中心法则已经无法解释复杂的肿瘤恶性生物学行为。值得关注的是,表观遗传学的紊乱在恶性肿瘤发生发展中发挥着重要的作用,而针对癌症发生、进展的关键表观事件,寻找新兴抗癌靶点的表观靶向治疗(Epigenetic Therapeutics)是新一代靶向药物设计和研发的新策略和新方向。溴结构域超末端蛋白(Bromodomain and extra terminal protein,BET)家族是近年来备受关注的潜在表观靶点之一。该家族的主要成员包括BRD2,BRD3,BRD4和BRDT(仅在睾丸组织中表达),而BRD4是当中最受关注的“明星分子”。作为“表观阅读器”(Epigenetic Reader),BRD4可以直接识别并结合于组蛋白乙酰化的赖氨酸残基,同时招募并形成一系列关键的调控复合物,如转录延长因子P-TEFb(CDK9蛋白的异源二聚体)、Jumonji结构域蛋白6(JMJD6)等协同调控众多癌基因的转录,从而促进肿瘤的发生与癌细胞的急速增殖。关键的癌基因原癌基因蛋白MYC与凋亡抑制蛋白BCL2是其重要的靶基因。然而,BRD4是否能调控除增殖外的其余肿瘤恶性生物学行为,及其独立于转录调控,是否存在其余调控方式尚不清楚。2011年,针对溴结构域的小分子抑制剂JQ1和I-BET一经问世,便因其显著的抑癌效应,受到了学界的广泛推崇。JQ1可以直接竞争性结合于BRD4的溴结构域,使其丧失识别乙酰化组蛋白赖氨酸残基的能力,从而直接、高效地抑制了如MYC与BCL2等癌基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖。目前,该抑制剂已经进入临床研究阶段(临床研究编号NCT01987362、NCT01587703、NCT01949883、NCT01713582以及NCT01943851),其未来的临床应用前景值得期待。但JQ1对于消化系统肿瘤,如胃癌、结肠癌的相关抑癌效应,以及BRD4在其中所发挥的效应与作用机制,尚不明确。锌指结构蛋白Snail是上皮间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)进程中的关键转录因子,它可以直接结合于钙粘蛋白1(CDH1)基因的启动子,抑制其转录,从而下调E钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,促进EMT,进而促进肿瘤细胞的侵袭、自我更新、化疗药物抵抗等恶性生物学行为。近来也有文献表明,独立于EMT,Snail依然可以发挥促癌因子的作用。分子机制上,Snail蛋白稳定性较差,半衰期仅为2-3小时,易受泛素-蛋白酶系统的调控,如β-TRCP1、FBXL14、FBXO11、A20等众多E3泛素连接酶参与了Snail稳定性的调控。但Snail的去泛素化或者抑制泛素化发生的相关机制,现在尚不清楚。近年来随着生活条件的不断提高以及幽门螺旋杆菌根治方案的不断优化与推广,胃癌发病率在全球范围内均有一定的下降。但我国依然是胃癌大国,其发病率与死亡率仅次于肺癌。胃癌起病隐匿,早期无明显特异性症状,患者就诊时往往已进入肿瘤进展阶段。而学界对于胃癌的认识较为有限,针对胃癌发病机制的相关研究相对较少,目前依然缺乏切实有助于指导临床的相关分子分型,因此,针对胃癌发生发展的机制研究具有较强的临床指导意义。就疾病预后而言,对于局限进展期胃癌(肿瘤浸润或粘连邻近器官,不管是否存在淋巴结转移,远处转移患者除外),因缺乏相应的分子靶点,加之学界对其缺乏统一的认识(中、美及欧洲的相关指南治疗方案各不相同),五年生存期仅为10%-15%。而对于已经发生远处转移的胃癌患者,其预后极差。已有多项临床研究尝试使用针对HER2、VEFG、EGFR等分子靶向药物联合传统的细胞毒性药物治疗转移性胃癌,其中一些方案在统计学水平上的确有助于改善患者的预后,但其总体生存期均无法超过一年,学界亟需对转移性胃癌(已发生远处转移的胃癌)这一预后较差的肿瘤亚型加深了解。人类基因组计划之后,多项基于高通量测序的研究表明,肿瘤细胞的转移往往伴随着表观遗传学组的失调。因此,针对转移性胃癌患者这一预特殊群体,研究其表观遗传学的异常如何驱动肿瘤细胞的相关恶性生物行为,并根据相关的机制研究进行靶向药物的筛选与开发具有较强的可行性与临床转化价值。有鉴于此,本文着重阐述了“表观阅读器”溴结构域蛋白BRD4识别并结合乙酰化修饰的Snail的蛋白,促进其稳定性的相关机制,及其对胃癌细胞侵袭、转移的相关调控作用。利用BRD4溴结构域抑制剂JQ1或者I-BET表观靶向BRD4/Snail轴是潜在的作为治疗转移性胃癌的新策略。本研究的主要结果及结论如下:1.BRD4在胃癌组织中的高表达提示着肿瘤的转移与不良预后(1)胃癌组织中BRD4的mRNA表达水平明显高于癌旁组织;(2)胃癌组织中BRD4的蛋白表达水平明显高于癌旁组织;转移性胃癌中BRD4蛋白的表达水平明显高于非转移组织;(3)BRD4在胃癌组织中的高表达提示患者的肿瘤转移与不良预后。2.BRD4促进胃癌细胞的侵袭、转移独立于其经典的靶基因MYC与BCL2(1)BRD4调控MYC的表达,促进胃癌细胞的增殖能力;(2)BRD4/MYC轴促进胃癌细胞在动物体内的成瘤能力;(3)BRD4缺失明显抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力;(4)BRD4敲除明显抑制胃癌细胞在动物体内的转移。3.BRD4通过转录后途径调控、稳定Snail的蛋白表达(1)过表达BRD4促进Snail蛋白的表达,而非mRNA的表达;(2)下调BRD4抑制Snail蛋白表达,而非mRNA的表达;(3)JQ1处理明显抑制Snail蛋白表达,而非mRNA的表达;(4)过表达BRD4促进Snail蛋白的稳定性,而敲除BRD4明显抑制Snail蛋白的稳定性。4.BRD4与Snail的乙酰化依赖性结合抑制Snail的降解性多聚泛素化(1)胃癌细胞内源性BRD4与Snail间存在共定位与相互结合;(2)JQ1抑制外源性BRD4与Snail间的相互结合;(3)内源性BRD4缺失促进Snail的多聚泛素化;(4)外源性过表达BRD4抑制Snail的多聚泛素化;(5)JQ1拮抗BRD4抑制的Snail多聚泛素化;(6)BRD4与Snail间的结合依赖于Snail的乙酰化;(7)高度保守的K146和K187为Snail与BRD4结合所需的关键乙酰化位点;(8)K146、K187的乙酰化缺失突变拮抗BRD4对Snail蛋白的稳定效应;(9)K146、K187的乙酰化缺失突变拮抗BRD4对Snail多聚泛素化的抑制效应。5.BRD4与Snail的E3泛素连接酶β-TRCP1和FBXL14竞争性结合Snail以促进其蛋白稳定性(1)外源性过表达BRD4抑制β-TRCP1和FBXL14对Snail的识别;(2)β-TRCP1和FBXL14对Snail的识别抑制Snail与BRD4间的结合;(3)内源性BRD4的缺失可以促进Snail与β-TRCP1和FBXL14的结合;(4)Snail乙酰化缺失突变促进Snail与β-TRCP1和FBXL14的结合;(5)BRD4与FBXL14竞争结合Snail相同的区域;(6)BRD4可以抑制GSK-3β对Snail的磷酸化从而抑制β-TRCP1对Snail的识别;(7)BRD4拮抗FBXL14对Snail的多聚泛素化修饰,促进Snail的表达;(8)BRD4拮抗β-TRCP1对Snail的多聚泛素化修饰,促进Snail的表达。6.BRD4/Snail轴是调控胃癌细胞侵袭、转移的关键信号通路(1)在BRD4缺失的胃癌细胞中重新激活Snail可以恢复受抑制的胃癌细胞迁移、侵袭能力;(2)在胃癌细胞中过表达野生型而非乙酰化缺失突变的Snail促进胃癌细胞迁移、侵袭能力;(3)在BRD4缺失的胃癌细胞中重新激活Snail可以恢复丧失的胃癌细胞在活体内的转移能力;(4)在BRD4缺失的胃癌细胞中重新激活Snail可以部分恢复胃癌细胞受损的增值能力;(5)BRD4在胃癌组织中的表达水平与Snail呈正相关;(6)Snail在胃癌组织中的表达水平与β-TRCP1和FBXL14呈负相关;(7)BRD4-Snail轴调控一系列肿瘤转移相关的信号通路。综上所述,本研究的主要结论为:(1)BRD4在胃癌组织尤其是转移性胃癌组织中高表达,而高表达的BRD4提示胃癌患者的不良预后,BRD4的表达水平是胃癌患者的独立预后因子;(2)高表达的BRD4结合发生乙酰化修饰的Snail蛋白,使其无法被其特异的E3泛素连接酶β-TRCP1和FBXL14所识别,进而抑制Snail蛋白的降解性多聚泛素化,促进其蛋白的稳定性;(3)BRD4通过稳定Snail蛋白促进胃癌细胞的迁移、侵袭能力,提升其在小鼠体内的转移的潜能;(4)靶向BRD4/Snail轴可以有效的抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力。本研究首次提出了BRD4参与胃癌细胞侵袭、转移的调控作用,阐明了表观识别蛋白BRD4除转录调控层面外新的调控机制,发现了BRD4通过与特异的E3泛素连接酶竞争性识别并结合关键的促癌因子Snail,并通过稳定其蛋白稳定性,进一步促进了胃癌细胞的侵袭与转移,提高了对BRD4这一具有重要功能分子的认识。BRD4作为对肿瘤细胞的增殖与侵袭、转移均能促进的促癌分子,是理想的抗癌表观靶点。运用溴结构域抑制剂靶向BRD4/Snail轴,是未来针对转移性胃癌患者进行表观靶向治疗的新选择和新方向。