【摘 要】
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单细胞测序技术是指在单细胞层面对细胞转录组、基因组进行分析的技术,能够揭示细胞间异质性,对于细胞亚型筛选、致病机理研究具有重要意义。微流控技术是在微纳尺度对流体进行处理,具有体积小、反应速度快、试剂消耗量小等优点,微液滴是其中非常重要的一个分支,基于微液滴的单细胞测序通量高,交叉污染程度低,被广泛应用于单细胞分析,然而,由于液滴在生成时液滴内包裹细胞与微珠的情况服从双泊松分布,为保证有效样本纯度,
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单细胞测序技术是指在单细胞层面对细胞转录组、基因组进行分析的技术,能够揭示细胞间异质性,对于细胞亚型筛选、致病机理研究具有重要意义。微流控技术是在微纳尺度对流体进行处理,具有体积小、反应速度快、试剂消耗量小等优点,微液滴是其中非常重要的一个分支,基于微液滴的单细胞测序通量高,交叉污染程度低,被广泛应用于单细胞分析,然而,由于液滴在生成时液滴内包裹细胞与微珠的情况服从双泊松分布,为保证有效样本纯度,造成了样本损失问题与有效样本比例过低的问题。针对此问题,本论文设计并实验了一种高通量液滴分选与融合的方案,旨在解决由双泊松分布问题造成的样本损失:1)通过分析双泊松分布在单细胞测序中造成的问题以及对比不同λ值生成液滴的类型比例,提出将双泊松分布变为两个独立的泊松分布,通过两次液滴包裹将细胞与微珠分别包裹进入液滴,之后通过液滴分选提高两种样本纯度,液滴融合将两种液滴进行融合,从而生成高纯度的有效样本。基于此方案,设计加工了一组微流控芯片,分别用于液滴生成、分选、融合、阵列。2)通过对比不同的液滴分选施力方式、检测目标,确定了基于介电泳的荧光激发液滴分选方案,通过COMSOL仿真对分选芯片的流场、电场、以及分选过程进行了研究,优化了流道结构、初始流速以及电压值。以倒置显微镜为主体,搭建了用于高通量荧光检测的光学系统;以PMT为接口,搭建了荧光检测的数据采集与控制系统,最后以包裹16μm荧光微球的液滴为样本,成功实现了荧光液滴的富集。3)本论文设计了一种新型的“主动被动相结合的液滴融合方案”,以凹槽结构为反应腔室,通过将曳力变化、介电泳力、电聚合相结合,实现液滴的捕获、等待、融合与释放。以50μm液滴为样本进行了液滴融合实验,液滴高通量融合。4)为方便观察与分析分选融合前后液滴的变化情况,本论文研究了一种大规模微液滴阵列芯片,通过实验成功将50μm液滴阵列在芯片中。
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