大米活性肽体外抗氧化机理的研究

来源 :中南林业科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:panzhengdang
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本课题主要研究大米蛋白中的活性肽对人脐静脉血管内皮细胞的保护机理,通过细胞、蛋白、分子三个水平来验证其抗氧化活性。以大米生产过程中的废料为原料,在前期课题组研究结果的基础上筛选出一条大米活性短链肽,通过氨基酸合成仪,得到适合细胞体外实验的高纯度活性肽,利用H2O2构建体外损伤模型,使用MTT、细胞流式仪筛选出大米活性肽的最佳保护时间及浓度,进而通过生长曲线,来直观的判断出细胞的存活率、凋亡率等,利用光镜、荧光显微镜观察细胞形态,利用HE染色法、Hoechst荧光染色法观查其形态及胞内细胞器的生长状况;再通过DNA损伤的彗星实验、细胞迁移的血管形成实验、验证调控RNA信号通路的qPCR实验进一步说明大米活性肽对氧化损伤HUVEC的保护作用,最后通过Western blot检测血管内皮细胞相关凋亡因子NF-κB在损伤情况下的调控作用机理。实验结果显示,大米活性肽(RBP)对H2O2氧化损伤的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC生存活力的影响,筛选出RBP在0.3 mg/mL下作用24 h对HUVEC的保护作用最佳,相较于天然抗氧化物Vc其抗氧化活性相差不大;细胞形态结构变化显示RBP保护组细胞形态与正常对照组相似,细胞结构完整,细胞形态规则且伸展良好,细胞器丰富,细胞表面平滑;损伤组细胞形态不规则,核膜内陷,核质外溢,细胞器形态不规则,细胞处于损伤状态;细胞凋亡实验表明大米活性肽保护组相比较于氧化损伤组其保护作用在50%以上。血管形成实验表明大米活性肽保护组可以形成形状规则的中空微管束,氧化损伤组则不能。qPCR、Western blot免疫印迹结果显示实验表明大米活性肽能下调由H2O2引起的HUVEC细胞中NF-κB蛋白的表达,通过抑制HUVEC的凋亡对HUVEC起到保护作用。研究结果表明,大米活性肽可以有效保护氧化损伤的HUVEC细胞,提高HUVEC细胞的生存活力,下调细胞凋亡因子NF-κB蛋白的表达。从细胞到分子水平均表现出良好的氧化活性。通过本文的研究将会为大米活性肽的后期深入开发利用提供强有力的理论支撑。
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