血吸虫病(schistosomiasis)作为被忽视的热带病之一仍然严重危害人类健康,我国流行的是日本血吸虫病(schistosomiasis japonica)。虽然50多年来我国血吸虫病防治工作取得了巨大的进展,但仍是我国重点防治的感染性疾病。肝脾肿大是慢性日本血吸虫病的显著特征之一,以往的研究集中于肝脏的病理损伤,而脾脏作为机体最大的外周免疫器官,其肿大的原因一度被归结为门静脉高压,具体损伤机制并无系统研究。我们前期研究发现日本血吸虫感染导致脾脏淋巴滤泡结构破坏,淋巴细胞凋亡,本研究试图进一步寻找导致该现象的血吸虫源分子,探讨其致脾脏淋巴滤泡结构破坏、淋巴细胞凋亡的机制,并对日本血吸虫感染晚期小鼠脾脏虫卵肉芽肿同淋巴滤泡结构重建现象之间的关系进行了初步研究。材料和方法1.日本血吸虫虫卵对小鼠脾脏结构的破坏1.1感染血吸虫不同时间小鼠脾脏虫卵沉积情况观察：C57BL/6雄性小鼠33只,每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴20条。分别于感染后第5、7、9、16周随机剖杀8-9只,取部分脾脏做石蜡切片,HE染色,显微镜下观察脾脏内虫卵的分布状况；其余脾脏研磨,计数脾脏虫卵密度。同时取小鼠部分肝脏用4%KOH溶液消化,计算肝组织中的虫卵密度。1.2血吸虫卵导致小鼠脾脏淋巴滤泡结构破坏的观察：C57BL/6雄性小鼠12只,随机分为虫卵尾静脉注射组、可溶性虫卵抗原(SEA)、可溶性成虫抗原(SWA)尾静脉注射组及脾脏手术注射虫卵组,每组3只。注射用新鲜虫卵调整至2500个/ml,尾静脉注射0.1ml/鼠,每周注射一次,持续注射4周；SEA50μg/鼠,隔天注射一次,持续4周；脾脏虫卵注射实验以手术方法打开小鼠腹腔,从脾脏下缘注入虫卵悬液0.1ml,约含250个虫卵。4周后剖杀各组小鼠,分离脾脏,固定后制作石蜡切片,HE染色观察虫卵对脾脏淋巴滤泡结构影响。另外C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为单性感染组(9只)、双性感染组(7只)和正常对照组(4只)。单性感染组以单只钉螺所逸得的尾蚴感染,剖杀时门静脉灌注法收集成虫观察性别,观察肝脏是否有虫卵结节以排除双性感染；双性感染组以常规方法多只钉螺逸得的血吸虫尾蚴感染,两组小鼠感染尾蚴剂量均为每鼠20条；未处理鼠4只作为正常对照组。3组小鼠于感染后9周剖杀,称量脾脏重量,石蜡切片观察各组小鼠脾脏结构。2.致小鼠脾脏T细胞凋亡的日本血吸虫虫卵蛋白分子量区段筛选2.1血吸虫感染小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的体内实验观察：C57BL/6雄性小鼠10只,每鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴20条。分别于感染后第5和第8周随机剖杀,取脾脏制备单细胞悬液,即刻以荧光标记的抗CD3、B220单抗及Annexin V标记脾脏细胞中总的T、B细胞及凋亡细胞,并计算T、B细胞在总的脾细胞中比例以及凋亡的T、B细胞占各自总量的比例。取感染后8周小鼠脾脏,‘TUNEL法检测有虫卵沉积部位细胞凋亡现象；虫卵脾脏注射组小鼠手术后48h剖杀,TUNEL法检测虫卵注射部位细胞凋亡现象。2.2血吸虫感染不同时间小鼠脾脏淋巴细胞体外在不同浓度SEA作用下凋亡的观察：随机分批感染小鼠,每组5只,每鼠经腹部皮肤感染20条尾蚴,各组小鼠同时间剖杀以建立血吸虫感染不同时间小鼠实验模型。取各组小鼠脾脏,制备单个淋巴细胞悬液,体外加入不同浓度SEA (15、30、60、120μg/ml)共培养,TUNEL法检测感染后不同时间(5、8、12、20周)脾脏总淋巴细胞细胞在不同浓度SEA刺激下凋亡情况。2.3不同处理方式模型小鼠脾脏淋巴细胞体外在不同浓度SEA作用下凋亡的观察：感染组、免疫组及正常对照各4只,感染组每鼠经腹部皮肤感染20条尾蚴,感染后8w剖杀；免疫组小鼠50μg SEA在等体积完全弗氏佐剂中乳化混匀,背部多点注射小鼠1次,14d后剖杀,正常小鼠作为对照。取各组小鼠脾脏制备单细胞悬液,体外加入不同浓度SEA (40、80、120μg/ml)培养48h,Annexin V标记不同组小鼠T、B细胞在不同浓度SEA刺激下凋亡情况。2.4血吸虫感染小鼠脾脏肉芽肿中T细胞分布观察：取感染日本血吸虫18周小鼠脾脏及肝脏,分别于固定后石蜡切片,免疫组化法比较脾脏及肝脏虫卵肉芽肿中CD3+细胞分布。2.5致小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡的SEA分子量区段筛选：制备SEA并即刻用16-60Superdex200层析柱按分子量将SEA进行初步分离,按照出峰先后顺序分离液收集为3个区段,分离液使用5kDa截留量超滤管浓缩,滤膜下方5kDa以下小分子物质以冷冻干燥方法浓缩作为区段4。取SEA免疫小鼠脾脏细胞,尼龙毛柱法分离T细胞,与不同SEA区段共培养48h,4个区段抗原使用浓度均为100μg/ml, Annexin V标记流式检测、DNA ladder法、RT-PCR检测T细胞中Fas、FasL mRNA水平等方法观察各区段致T细胞凋亡情况,选取致凋亡作用最为显著的蛋白区段进一步将蛋白分为3个亚区段,多次电洗脱富集不同亚区段蛋白,同样方法以60μg/ml的浓度同T细胞共培养,Annexin V标记流式检测法将SEA中致凋亡蛋白分子量区间进一步缩小。3.日本血吸虫感染晚期小鼠脾脏淋巴滤泡结构重建的初步研究C57BL/6小鼠30只,感染日本血吸虫18周剖杀,按照脾脏表面有无虫卵肉芽肿分为2组,即脾脏肉芽肿组和脾脏非肉芽肿组。石蜡切片HE染色观察脾脏肉芽肿组脾脏淋巴滤泡结构重建现象；ELISA法比较脾脏肉芽肿组及非肉芽肿组血清特异性抗体水平、淋巴细胞体外分泌细胞因子水平；免疫组化法观察重建淋巴滤泡中B220+及CD3+淋巴细胞构成,直接免疫荧光法观察其PNA阳性生发中心有无,同时流式检测组间CD4+T细胞中淋巴滤泡辅助性T细胞(Yfh)比例。结果1.日本血吸虫虫卵对小鼠脾脏结构的破坏1.1感染血吸虫不同时间小鼠脾脏虫卵沉积情况观察：感染日本血吸虫后5周,小鼠肝脏均检测到少量虫卵沉积,而脾脏此时并未检测到虫卵(0/8)。感染后7周,肝脏虫卵数目猛增,脾脏也有虫卵阳性出现,并随着感染进程虫卵出现在脾脏的频率及数目都逐渐增加,感染后9周有虫卵沉积于脾脏的小鼠已超过半数(6/8),提示日本血吸虫感染小鼠模型中,虫卵沉积于脾脏是非常普遍的现象。HE染色石蜡切片观察脾脏中虫卵时发现脾脏中虫卵可以同在肝脏中一样形成虫卵肉芽肿,这种肉芽肿几乎无一例外的出现在脾脏边缘被膜部位,而沉积于脾脏髓质区的虫卵,即便是在感染后16周也并未形成虫卵肉芽肿。1.2血吸虫卵导致小鼠脾脏淋巴滤泡结构破坏的观察：尾静脉注射虫卵及SEA、SWA4周后,同正常小鼠相比,虫卵注射组小鼠脾脏淋巴滤泡数目减少,边缘区模糊难辨,而SEA、SWA注射组同正常组小鼠相比脾脏结构并无显著区别。手术将虫卵注射入小鼠脾脏4周后,虫卵注射部位淋巴滤泡萎缩甚至消失。小鼠感染日本血吸虫单性尾蚴后9周肝脏皆光滑无虫卵结节,对门静脉灌注法收集到的成虫观察证实小鼠确为单一性别感染,表现为不能分辨性别的幼虫或单性雄虫。其中单性雄虫长度大小与双性尾蚴感染所得雄虫相比几乎无差别,但双性尾蚴感染组脾肿大现象较正常及单性感染组严重得多,双性尾蚴感染组(n=7,0.41g+0.03g)小鼠脾脏重量显著高于正常对照组(n=4,0.07g±0.01g)(F=60.914, P<0.001)及单性感染组(n=9,0.15g±0.01g)(P<0.001)。HE染色脾脏切片显示单性感染组小鼠脾脏淋巴滤泡未被破坏,双性感染组脾脏淋巴滤泡消失。2.致小鼠脾脏T细胞凋亡的日本血吸虫虫卵蛋白分子量区段筛选2.1血吸虫感染小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的体内实验观察：感染日本血吸虫8周小鼠脾脏虫卵肉芽肿中检测到细胞凋亡,新鲜虫卵注射入小鼠脾脏48h后虫卵周围同样检测到细胞凋亡且仅出现在虫卵周围。流式检测结果显示,同正常小鼠相比,感染日本血吸虫后8周到脾脏T(F=11.143,P<0.01)和B(F=33.789,P<0.001)淋巴细胞数目都显著下降；感染后8周小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡显著(F=12.436,P<0.01)高于正常组,而此时B细胞凋亡并不显著(P>0.05);感染后5周,不论是T、B细胞数目(P>0.05)还是细胞凋亡率(P>0.05)同正常组相比都无显著差异；感染后8周T细胞凋亡率显著高于B细胞(t=2.711,P<0.01)。2.2血吸虫感染不同时间小鼠脾脏淋巴细胞体外在不同浓度SEA作用下凋亡的观察：感染后各个时间点(5、8、12、20周)小鼠脾脏淋巴细胞体外在120μg/ml SEA浓度作用下细胞凋亡比例都高于60μg/ml,同样浓度SEA作用下,感染后8周小鼠脾脏淋巴细胞凋亡最为显著,120μg/ml浓度下细胞凋亡率达到55.77%,15、30μg/ml的SEA浓度上看不到细胞凋亡比例随浓度增加而变化。2.3不同处理方式模型小鼠脾脏淋巴细胞体处在不同浓度SEA作用下凋亡的观察：感染组、免疫组小鼠脾脏淋巴细胞体外在递增的SEA浓度作用下,表现出相似的趋势,即T细胞凋亡率随SEA浓度递增而逐渐增加,120μg/ml浓度下细胞凋亡率显著高于80μg/ml (F=0.139, P<0.05; F=47.608, P<0.001),但B细胞凋亡组间差异不大且无递增趋势,120μg/ml浓度下细胞凋亡率同80μg/ml相比无显著差异(F=0.513,P>0.05；F=26.490,P>0.05)。正常组小鼠脾脏细胞体外SEA作用下细胞凋亡率相比前两组无规律可循,同40μg/ml相比,T细胞在120μg/ml SEA作用下细胞凋亡并不显著(P>0.05)。2.4血吸虫感染小鼠脾脏肉芽肿中T细胞分布观察：日本血吸虫感染18周小鼠脾脏虫卵肉芽肿中仍有大量CD3+淋巴细胞分布于虫卵周围,而同时间肝脏肉芽肿中却无明显T细胞分布。2.5致小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡的SEA分子量区段筛选：SEA用16-60Superdex200层析柱及超滤管按分子量初步分离为4个分子区段,蛋白分别富集于Frl,>55kDa; Fr2,30-70kDa; Fr3,5-30kDa; Fr4,<5kDa。免疫小鼠脾脏T细胞体外加入100μg/ml的不同SEA区段分子,培养48h后,以Annexin V标记流式检测,DNA ladder法,RT-PCR检测T细胞中Fas, FasL mRNA水平等方法检测各区段刺激细胞凋亡水平,得出Frl蛋白组分致T细胞凋亡最为明显,将SDS-PAGE上Frl分子进一步电洗脱富集不同亚区段蛋白(Frl-1,Frl-2, Frl-3),以60μg/ml的浓度刺激T细胞48h,最终Annexin V法结果显示Frl-2:55-72kDa亚蛋白区段致T细胞凋亡率达到57.04%,致凋亡结果最为显著(P<0.001)。3.日本血吸虫感染晚期小鼠脾脏淋巴滤泡结构重建的初步研究从小鼠感染日本血吸虫8周开始,观察到脾脏虫卵肉芽肿现象,石蜡切片发现有虫卵肉芽肿的脾脏随着感染进程,脾脏淋巴滤泡能够恢复重建,而无虫卵肉芽肿形成的脾脏无此现象。肉芽肿组小鼠虽然脾脏淋巴滤泡恢复重建,但重建的淋巴滤泡没有明显T细胞区,也不能检测到像感染5周小鼠脾脏切片上观察到的PNA阳性的生发中心。感染18周小鼠脾脏肉芽肿组血清抗体IgG2a、IgG1、IgG及IgM水平皆高于脾脏非肉芽肿组,但除了IgG2a水平差异较为显著(t=4.956,p<0.05), IgG1、IgG及IgM抗体水平组间皆未发现显著性差异。体外SEA或ConA刺激下,2组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-2及IFN-y水平组间差异不大,而脾脏肉芽肿小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-4(F=25.119,p<0.001)及IL-5(F=14.234, p<0.001)细胞因子水平显著高于非肉芽肿小鼠。而SEA刺激下,非肉芽肿组小鼠脾脏淋巴细胞IL-17的分泌显著高于脾脏肉芽肿组(F=1.209,p<0.05)。流式检测却发现脾脏肉芽肿组小鼠脾脏CD4+T细胞中ICOS、CXCR5双阳性的淋巴滤泡辅助性T细胞(Tfh)比例高于非肉芽肿组。结论1.感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠随着感染进程脾脏中虫卵沉积的数目和频率都增加,日本血吸虫虫卵对脾脏淋巴滤泡结构有破坏作用。2.沉积于小鼠脾脏的日本血吸虫虫卵可能通过诱导脾脏细胞凋亡对脾脏造成损伤,高浓度的SEA体外诱导脾脏T细胞凋亡,其中55～72kDa蛋白区段致T细胞凋亡结果最为显著。3.日本血吸虫感染小鼠破坏的淋巴滤泡结构在感染晚期存在重建现象,初步发现脾脏虫卵肉芽肿可能改变脾脏局部微环境,使其Th2反应显著,推测有利于脾脏淋巴滤泡重建。