研究背景:乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一,我国虽是低发地区,但随着国民经济的发展和生活水平的提高,发病率也呈逐年上升趋势,近年来,城市乳腺癌患者的死亡率也成为上升最快的肿瘤之一。乳腺癌最主要、最常见的转移途径是淋巴转移,乳腺癌早期患者可出现由局部淋巴管转移到周围淋巴结,乳腺癌淋巴管生成(lymphangiogenesis)在淋巴转移过程中起着至关重要的作用,是决定乳腺癌分期和选择治疗方案最关键的因素。新近发现的血管内皮生长因子-C(Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)、血管内皮生长因子-D(Vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D)及其受体 VEGFR-3(Vascular endothelial growth factor receptor-3)在肿瘤淋巴管生成及转移过程中发挥了重要作用,VEGF-C、D/VEGFR-3信号通路为乳腺癌的淋巴管生成和淋巴转移创建了有利环境。而且随着研究的不断深入,逐渐发现了更多的信号通路参与淋巴管生成,信号通路间存在着复杂的交叉对话,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)是其中较为重要的信号通路之一。PI3K/AKT信号通路在细胞生长增殖、分化凋亡、肿瘤发生、转移耐药等过程中都起着重要的调控作用,它与多种信号调控分子交叉作用,构成了复杂的网络调控通路。PI3K信号通路下游重要分子AKT主要参与PI3K始动过程的生物学调控,AKT功能在涉及细胞生长增殖调控和凋亡程序启动外,也在肿瘤血管、淋巴管生成和侵袭转移等病理过程中发挥重要的角色。在PI3K/AKT信号通路中,AKT通过残基Thr308和Ser473的磷酸化而被激活发挥其功能。有研究表明在乳腺浸润性导管癌中,多种细胞因子可通过作用于乳腺癌细胞膜部位的受体激活细胞膜处的酪氨酸激酶,进而转导细胞外信号至细胞内,促使AKT磷酸化过程,磷酸化AKT(p-AKT)可促使下游VEGF-C蛋白表达和淋巴管生成,AKT蛋白在肿瘤的血管生成和淋巴管的发展中起着重要的作用。p-AKT是PI3K信号通路中的关键分子靶标,它处于PI3K信号通路中的上游,可加速下游多种生物分子的活化过程,进而加速乳腺癌的发生和发展,也可使乳腺癌传统的治疗药物产生耐药性,可以作为乳腺癌基因治疗的候选靶点。PI3K/AKT信号通路的活性受抑癌基因类脂磷酸酶PTEN和SHIP2的负调节,PTEN是一个明确的肿瘤抑制基因,能够阻断PI3K/AKT信号通路来调节多种细胞过程。SHIP基因可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,致使PI3K/AKT通路失活,SHIP的部分缺失可能激活PI3K/AKT信号通路。microRNAs(miRNAs,miRs)具有明显的组织特异性特征,特别是在恶性肿瘤中表现更为突出,研究发现,microRNAs具有不同的表达方式,甚至部分miRNAs在生物体整体细胞中均有表达,但一些microRNAs在不同的组织结构或不同发育的时间段表达水平存在明显的差异。相关研究显示,microRNAs在肿瘤的发展进程中发挥着关键的调控作用,这些microRNAs以致癌基因/促癌基因或抑癌基因的角色发挥具体的作用,鉴于这种特异性特点,检测肿瘤组织中特定的miRNA表达有助于肿瘤的辅助诊断,并可预测患者的预后状况,也可以评估临床疗效,为制定合理的治疗方案提供理论支撑。在乳腺癌中,miR-139-5p、miR-33b、miR-27b、miR-204 等多种 miRNAs 及其作用越来越受到重视。与乳腺癌进展相关的关键miRNA的已经成为近年来研究的热点。miR-3941被鉴定为通过介导免疫球蛋白结合蛋白1(IGBP1)表达来调节乳腺癌的发生进展过程。ABC(ATP-binding cassette)亚家族A成员6(ABCA6)和miR-3941之间的相互作用也被发现参与到结直肠癌的发生发展。鉴于AKT磷酸化和miR-3941在乳腺癌中的具体作用尚不清楚,还需要深入研究,为了进一步澄清AKT磷酸化和miR-3941在乳腺癌中的作用及其可能的分子机制,本研究进行了以下两部分内容的研究,第一章为AKT磷酸化在乳腺癌淋巴转移的作用研究,第二章为microRNA-3941调控IGF-1在乳腺癌细胞中的作用机制研究,以期深入分析miR-3941和AKT磷酸化在乳腺癌发病中的具体作用及其可能的信号通路,为乳腺癌早期诊断、疗效评估及预后预测提供可能的分子生物学标记物,并为探索其新型基因靶向治疗提供新方向。第一章 AKT磷酸化在乳腺癌淋巴转移的作用研究研究目的:检测乳腺癌标本淋巴管生成(微淋巴管密度LMVD)、相关调控因子VEGF-C、VEGFR-3、Survivin、Ang2、PI3K、AKT、p-AKT(Thr308)、p-AKT(Ser473)及抑癌因子SHIP、PTEN的表达水平;解析AKT磷酸化水平和乳腺癌的淋巴管密度、淋巴管生长因子及淋巴结转移情况的关系。探究在乳腺癌的淋巴转移过程中,AKT磷酸化在PI3K/AKT通路、VEGF-C、D/VEGFR-3信号通路中作用方式及其作用机制,阐明上述因子相互作用在调控淋巴管生成过程中的具体分子机制,以期为抑制乳腺癌淋巴转移提供依据和有效的靶点。研究方法:1收集临床资料完整的60例乳腺癌组织标本,石蜡包埋,切片,免疫组化法检测 VEGF-C、VEGFR-3、LMVD、Survivin、Ang2、PI3K、AKT、P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)及抑癌因子 SHIP、PTEN 蛋白的表达水平。2选取20例乳腺浸润性导管癌患者的新鲜标本,Western-blot法检测组织中 VEGF-C、VEGFR-3、P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)及抑癌因子 SHIP、PTEN蛋白的表达水平。3选取20例乳腺浸润性导管癌患者新鲜标本,RT-PCR法检测组织中VEGF-C、VEGFR-3、PI3K、AKT、PTEN、SHIP、Survivin、Ang2mRNA 的表达水平。解析AKT磷酸化水平和乳腺癌的淋巴管密度、淋巴管生长因子及淋巴结转移情况的关系。结果:1免疫组化法检测结果分析1.1乳腺癌组织中PI3K和AKT与VEGFR-3的表达及相关性在60例乳腺癌组织中,PI3K阳性表达率66.67%(40/60),AKT阳性表达率61.67%(37/60),VEGFR-3阳性表达率86.67%(52/60);与无淋巴结转移组PI3K阳性表达率53.57%(15/28)比较,淋巴结转移组PI3K阳性表达率78.13%(25/32)明显升高,二者比较具有统计学差异(X2=4.051,P=0.044);与无淋巴结转移组AKT阳性表达率50.00%(14/28)比较,淋巴结转移组AKT阳性表达率71.88%(23/32)显著升高,二者比较具有统计学差异(X2=4.029,P=0.045)。与无淋巴结转移组VEGFR-3阳性表达率75.00%(21/28)比较,淋巴结转移组VEGFR-3阳性表达率96.89%(31/32)显著升高,二者比较具有统计学差异(X2=4.436,P=0.035)。提示乳腺癌患者中淋巴结转移患者PI3K、AKT、VEGFR-3表达明显高于无淋巴结转移患者,PI3K、AKT、VEGFR-3与乳腺癌病情的进展密切相关。临床检测结果显示,PI3K阳性表达组患者中VEGFR-3阳性表达率为95.00%(38/40),PI3K阴性表达组患者中VEGFR-3阳性表达率70.00%(14/20);AKT阳性表达组患者中VEGFR-3阳性表达率为94.59%(35/37),AKT阴性表达组患者中VEGFR-3阳性表达率为73.91%(17/23)。Spearman相关性分析结果显示,乳腺癌患者组织中PI3K表达与VEGFR-3表达呈显著正相关(r=0.369,P=0.004);乳腺癌患者组织中AKT表达与VEGFR-3表达也呈显著正相关(r=0.415,P=0.001)。提示P13K、AKT、VEGFR-3均在乳腺癌的发病中发挥重要的角色。1.2 LMVD计数、Survivin和Ang2在乳腺癌组织中的表达60例乳腺癌标本中,LMVD计数为(16.39±3.16)个/HP。淋巴结转移组的LMVD计数(18.84±4.12)个/HP明显高于无淋巴结转移组LMVD计数(14.45±3.71)个/HP,二者比较具有统计学差异(tt=4.312,P=0.000)。Survivin在乳腺癌组织中的阳性表达率为85.00%(51/60),Ang2在乳腺癌组织中的阳性表达率为73.33%(44/60);与无淋巴结转移组患者Survivin阳性表达率71.43%(20/28)比较,有淋巴结转移组患者Survivin 阳性表达率96.86%(31/32)明显升高,二者比较具有统计学差异(X2=5.72,P=0.020)。与无淋巴结转移组患者Ang2阳性表达率57.14%(16/28)比较,有淋巴结转移组患者Ang2阳性表达率87.50%(28/32)明显升高,二者比较具有统计学差异(X2=7.04,P=0.008);乳腺癌组织Survivin表达、Ang2表达与患者肿瘤大小、年龄、组织病理分期差异无显著性(P>0.05)。临床资料分析显示,乳腺癌Survivin阳性表达组中Ang2的阳性表达率为74.51%(38/51),乳腺癌Survivin阴性表达组中Ang2的阳性表达率为66.7%(6/9),Spearman相关分析结果显示,乳腺癌中Survivin表达与Ang2表达呈正相关(r=0.325,P=0.012)。1.3乳腺癌组织中p-AKT、PTEN、SHIP、VEGF-C的表达情况分析60例标本中,乳腺癌组织p-AKT308和p-AKT473的阳性表达率分别为70.00%(42/60)和65.00%(39/60);与无淋巴结转移组p-AKT308阳性表达率46.43%(13/28)比较,有淋巴结转移组p-AKT308阳性表达率90.63%(29/32)明显升高,二者比较具有统计学差异(X2=13.891,P=0.002)。与无淋巴结转移组p-AKT473阳性表达率35.71%(10/28)比较,有淋巴结转移组p-AKT473阳性表达率90.63%(29/32)明显升高,二者比较具有统计学差异(X2=19.792,P=0.000)。乳腺癌组织P-AKT308表达、P-AKT473表达与肿瘤组织大小、年龄、TNM分期无关(P>0.05)。60例标本中,乳腺癌组织VEGF-C、PTEN、SHIP的阳性表达率分别为81.67%(49/60)、56.67%(34/60)、61.67(37/60)。与无淋巴结转移组 VEGF-C 阳性表达率60.71%(17/28)比较,有淋巴结转移组VEGF-C阳性表达率100.00%(32/32)明显升高,二者比较具有统计学差异(X2=20.863,P=0.000)。与无淋巴结转移组PTEN阳性表达率82.14%(23/28)比较,有淋巴结转移组PTEN阳性表达率34.38%(11/32)明显降低,二者比较具有统计学差异(X2=13.877,P=0.000)。与无淋巴结转移组SHIP阳性表达率89.29%(25/28)比较,有淋巴结转移组SHIP阳性表达率37.50%(12/32)明显降低,二者比较具有统计学差异(X2=16.942,P=0.000)。乳腺癌组织中p-AKT308阳性表达中VEGF-C的阳性表达率为92.86%(39/42),患者p-AKT308表达阴性中VEGF-C阳性表达率为55.56%(10/l8);乳腺癌组织中p-AKT473表达阳性的病例中VEGF-C阳性表达率为94.87%(37/39),患者p-AKT473表达阴性中VEGF-C阳性表达率为57.14%(12/21),经Spearman 相关分析,p-AKT308 与 VEGF-C 表达成正相关(r=0.5677,P=0.000)。p-AKT473 与 VEGF-C 表达成正相关(r=0.455,P=0.000)。2 Western-blot检测结果分析20例新鲜标本中,人乳腺浸润性导管癌患者中12例患者合并淋巴结转移,8例患者无淋巴结转移,有淋巴结转移的患者VEGF-C、VEGFR-3、AKT、p-AKT308、p-AKT473均有表达,PTEN有3例不表达,SHIP有4例不表达。在无淋巴结转移的病例中,VEGF-C有1例不表达,VEGFR-3有2例不表达、p-AKT308有2例不表达、p-AKT473有3例不表达,AKT、PTEN、SHIP均有表达。与无淋巴结转移组乳腺癌组织中的VEGF-C、VEGFR-3、AKT、P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)表达比较,有淋巴结转移组乳腺癌组织中的VEGF-C、VEGFR-3、AKT、P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)表达明显升高,比较结果均具有统计学差异(P<0.05)。然而,与无淋巴结转移组乳腺癌组织中的抑癌因子PTEN、SHIP蛋白表达比较,有淋巴结转移组乳腺癌组织中的抑癌因子PTEN、SHIP蛋白表达明显降低,比较结果均具有统计学差异(P<0.05)。20例人乳腺浸润性导管癌新鲜标本中P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)的相对表达量分别为0.20±0.13、0.25±0.19,LMVD计数为16.39±5.49。经直线相关分析,P-AKT308 表达与 LMVD 成正相关(r=0.922,P<0.01)。P-AKT(Ser473)阳性表达与LMVD成正相关(r=0.946,P<0.01)。3RT-PCR检测结果分析20例人乳腺浸润性导管癌患者新鲜标本中,在有淋巴结转移的乳腺癌组织中,VEGF-C、VEGFR-3、Survivin、Ang2 及 PI3K、AKTmRNA 均出现表达,3例患者PTEN不表达,4例患者SHIP不表达。无淋巴结转移患者乳腺癌组织中,1例患者出现AKT不表达,3例患者出现VEGF-C不表达,VEGFR-3有2例不表达,其余均有表达。与无淋巴结转移组乳腺癌组织中的VEGF-C、Ang2、PI3K、AKTmRNA相对表达量比较,有淋巴结转移组乳腺癌组织中的VEGF-C、Ang2、PI3K、AKT mRNA表达水平明显升高,比较结果均具有统计学差异(P<0.05)。与无淋巴结转移组乳腺癌组织中的Survivin、PTEN、SHIPmRNA相对表达量比较,有淋巴结转移组乳腺癌组织中的Survivin、PTEN、SHIPmRNA表达水平明显降低,比较结果均具有统计学差异(P<0.05)。有淋巴结转移组乳腺癌组织中的VEGFR-3 mRNA和无淋巴结转移组乳腺癌组织中的VEGFR-3 mRNA比较,结果无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)在乳腺癌组织中,存在淋巴管生成信号通路VEGF-C/VEGFR-3相关因子VEGF-C、VEGFR-3的蛋白和基因的表达以及淋巴管的生成,且有淋巴结转移患者VEGF-C、VEGFR-3阳性表达率及淋巴管计数明显高于无淋巴结转移患者。(2)乳腺癌患者PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、AKT以及磷酸化P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)均存在较高的表达,且有淋巴结转移患者PI3K、AKT以及磷酸化P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)表达明显高于无淋巴结转移患者。提示PI3K/AKT信号通路与乳腺癌淋巴转移有关。(3)抑癌因子PTEN、SHIP参与了乳腺癌淋巴管生成和淋巴转移环节,无淋巴结转移患者PTEN、SHIP表达高于淋巴结转移患者。(4)在乳腺癌组织磷酸化AKT表达与VEGF-C表达、VEGFR-3表达、淋巴管计数呈显著正相关,但与PTEN表达、SHIP表达呈显著负相关,说明AKT的磷酸化有助于促使VEGF-C、VEGFR-3的表达,PTEN、SHIP起到负调控作用,诱导了淋巴管生成,进一步促进了乳腺癌的淋巴转移。(5)在乳腺癌组织中AKT磷酸化通过介导PI3K/AKT信号转导通路促进细胞因子分泌增加,也与VEGF-C、D/VEGFR-3信号通路分子的相互作用,促使乳腺癌组织内的淋巴管生成,这可能是乳腺癌出现淋巴转移的机制。第二章 microRNA-3941调控IGF-1在乳腺癌细胞中的作用机制研究研究目的:检测miR-3941、胰岛素样生长因子1(IGF-1)在乳腺癌组织和细胞中的表达,进一步研究miR-3941的过度表达和抑制效应对癌细胞增殖、侵袭和转移的影响,基于第一章内容“AKT磷酸化在乳腺癌淋巴转移中的作用”中我们已经证实:乳腺癌患者PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、AKT以及磷酸化P-AKT(Thr308)、P-AKT(Ser473)均存在较高的表达,提示乳腺癌淋巴转移与PI3K/AKT信号通路有关。进一步解析miR-3941与IGF-1之间的调控关系,已知IGF-1为PI3K/AKT通路的上游分子,但具体机制如何,探究IGF-1对AKT磷酸化的影响及进一步通过PI3K/AKT信号转导通路参与乳腺癌发生进展的可能的作用机制,以期阐明miR-3941在乳腺癌发生进展中的关键作用和可能的调控机制。研究方法:选取60名乳腺癌患者为研究对象,收集乳腺癌癌组织及其匹配的正常组织。同时选取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和乳腺上皮细胞系MCF-10,采用阳离子脂质体法对miR-3941模拟物(mimic)、miR-3941抑制物(inhibitor)、Scramble RNA 和 IGF-1 特异性小干扰 RNA(siRNA)进行瞬时转染,小分子抑制物LY294002阻断PI3K/AKT信号通路,MTT法测定细胞增殖,使用克隆性分析法来评估细胞增殖,Transwell小室细胞迁移实验及体外侵袭实验分析检查细胞迁移和侵袭以及IGF-1作用靶点,使用双荧光素酶报告基因测定法评估IGF-1和miR-3941之间的目标关系。Western Blot蛋白质印迹法检测乳腺癌组织、细胞中IGF1蛋白、E-钙粘蛋白,N-钙粘蛋白和波形蛋白表达,RT-PCR检测乳腺癌组织miR-3941、IGF1 mRNA表达。结果:1.miR-3941和IGF-1在乳腺癌组织和细胞中的逆表达miR-3941在乳腺癌组织中的表达低于相邻的正常乳腺组织(P<0.01)。体外细胞分析显示,与正常乳腺上皮MCF-10细胞中的表达相比,MDA-MB-231细胞中的miR-3941也以较低水平表达(P<0.01)。另外,与在相邻的正常组织和正常细胞中的表达相比,IGF-1在乳腺癌组织和MDA-MB-231细胞中均高表达(P<0.01)。提示乳腺癌组织和细胞中miR-3941和IGF-1的逆表达。2 miR-3941过表达抑制乳腺癌细胞活力用miR-3941模拟物和miR-3941抑制剂转染MDA-MB-231细胞。我们发现miR-3941模拟组miR-3941的表达显着上调,miR-3941抑制剂组显着下调(P<0.05),这表明miR-3941在乳腺癌MDA-MB-231细胞中分别被成功过表达和抑制。此外,MTT检测结果显示,与对照组和扰乱组相比,miR-3941过表达导致细胞活力显着降低,而在miR-3941抑制后观察到相反的效果(P<0.05)。此外,菌落检测结果与MTT检测结果一致,表明在miR-3941过表达后菌落数目显着减少,在miR-3941抑制后明显增加(P<0.05)。表明miR-3941过表达显着抑制乳腺癌细胞增殖。3 miR-3941过表达可能通过调节EMT相关蛋白显著抑制癌细胞的迁移和侵袭使用Transwell分析评估miR-3941失调对细胞迁移和侵袭的影响。与对照组相比,miR-3941过表达后迁移或侵袭细胞数量显着减少,miR-3941抑制后显着增加(P<0.05)。此外,与干扰组或对照组相比,miR-3941过表达后E-cadherin的表达显着上调,而N-cadherin和vimentin表达下调(P<0.05)。在miR-3941抑制后观察到这些蛋白表达的相反趋势(P<0.05)。表明miR-3941过表达可能通过上调E-钙粘蛋白和下调N-钙粘蛋白和波形蛋白来抑制细胞迁移和侵袭。4 IGF-1 是 miR-3941 的靶标与对照细胞相比,miR-3941过表达后,携带IGF-1 3’-UTR-WT的细胞的相对荧光素酶活性显着降低(P<0.05)。miR-3941对IGF-1 3’-UTR的预测结合位点的突变恢复了荧光素酶活性的降低(P<0.05)。此外,miR-3941模拟组IGF-I表达显着降低,而miR-3941抑制剂组显着升高(P<0.05)。表明IGF-1是miR-3941的直接靶标,并且miR-3941负向调节IGF-1的表达。5 miR-3941过表达通过靶向IGF-1调节迁移、侵袭和EMT相关蛋白与对照组相比,si-IGF-1转染后IGF-1的表达显着降低(P<0.01),表明IGF-1被成功敲除。此外,我们发现,当miR-3941模拟物和si-IGF-1共转染细胞时,miR-3941过表达对细胞迁移和侵袭的抑制作用被逆转(P<0.05)。此外,当miR-3941模拟物和si-IGF-1共转染细胞时,miR-3941过表达诱导的E-钙粘蛋白表达增加和N-钙粘蛋白和波形蛋白表达降低显着逆转(P<0.05)。此外,与miR-3941抑制剂和si-IGF-1共转染时,miR-3941抑制对细胞迁移,细胞侵袭和EMT相关蛋白的影响也被逆转(P<0.05)。表明miR-3941的过表达可以通过靶向IGF-1来调节乳腺癌细胞中的迁移,侵袭和EMT相关蛋白。6 IGF-1通过PI3K/AKT信号通路AKT磷酸化调控乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移在浓度为60mg/L的IGF-1作用下,MDA-MB-231细胞迁移能力增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);当PI3K/AKT信号通路被LY294002阻断后,抑制了 MDA-MB-231细胞的迁移,同时对于IGF-1干预下的细胞迁移能力也有抑制作用,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。应用IGF-1干预30min后,磷酸化AKT(Thr308/Ser473)的表达显著增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。表明IGF-1可以增强乳腺癌细胞的迁移能力,PI3K/AKT信号通路可能为IGF-1增强作用的途径,而关键分子AKT的磷酸化可能为核心靶点。结论:(1)乳腺癌组织和乳腺癌MDA-MB-231细胞中miR-3941表达下调,IGF-1表达上调,miR-3941和IGF-1参与了乳腺癌的发生发展过程。(2)miR-3941过表达可能通过上调E-钙粘蛋白和下调N-钙粘蛋白和波形蛋白来抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。(3)IGF-1是miR-3941的直接靶标,并且miR-3941负向调节IGF-1的表达,miR-3941的过表达可通过靶向IGF-1来调节乳腺癌细胞中的迁移、侵袭和EMT相关蛋白。(4)miR-3941在乳腺癌细胞中表达下调,miR-3941的下调可能通过靶向调控IGF-1来促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其作用的发挥可能是通过PI3K/AKT信号通路实现,AKT的磷酸化是关键的靶点,miR-3941和IGF-1可作为乳腺癌治疗的诊断标记或潜在靶标。