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一、研究背景和目的难治复发性急性髓系白血病(refractory and relapsed acute myeloid leukemia,RR-AML)的治疗是目前的一个难题?白血病细胞耐药的一个重要原因是骨髓龛保护白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)免受化疗药物的杀伤作用,具有高黏附和促增殖特性的异常造血微环境可能是其耐药和复发的根源?目前的骨髓龛模型的建立多集中在2D的接触或非接触的培养体系中?然而2D培养体系中细胞失去极性,不能构筑空间结构,并不能真实地模拟机体微环境?而3D聚苯乙烯支架的空间分布可以更好地模拟复杂的机体微环境,3D培养越来越多地应用于体外细胞培养中?SDF-1/CXCR4在白血病细胞潴留在造血龛中起着关键作用?我们猜测阻断LSCs与造血龛相互作用,促使白血病细胞“失巢”,可能起到增敏作用?AMD3100作为CXCR4阻断剂,能够阻断SDF-1/CXCR4轴的作用;在移植动员造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)中应用较多,能否在化疗中促进白血病细胞的“失黏附”研究较少;G-CSF是动员HSCs的金标准,它能够促进HSCs从骨髓进入到外周循环?G-CSF在RR-AML患者预激方案中也有着广泛的应用,但其确切的机制以及能否促使白血病细胞的“失巢”目前研究较少。在本研究中,我们首先采用3D聚苯乙烯支架及体外诱导培养的成骨细胞构建体外模拟的成骨细胞龛模型,探讨其屏蔽化疗药物对白血病细胞的杀伤作用,然后比较不同培养体系屏蔽化疗药物对白血病细胞杀伤作用的差异,并应用AMD3100和G-CSF药物探究对成骨龛和白血病细胞之间黏附?迁移?周期?凋亡以及对化疗药物的影响,为难治性白血病的治疗提供新的方案和理论依据?二、研究内容及方法1.体外白血病成骨龛的建立及2D与3D培养体系的比较1.1初治急性髓系白血病患者间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的培养及鉴定;1.2 MSCs接种于聚苯乙烯支架上进行培养,并行成骨细胞诱导;扫描电镜检测细胞黏附聚苯乙烯支架的形态学特性;1.3诱导7,14,21天收集培养上清用ELISA方法检测SDF-1,并用ALP检测试剂盒检测细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达水平;1.4茜素红法及ALP染色法鉴定成骨细胞1.5加入Ara-C(0.2ug/m L)作用24小时,观察基质细胞对白血病细胞细胞周期及凋亡的影响,比较2D和3D的差异。2.AMD3100及G-CSF阻断SDF-1/CXCR4信号通路对白血病细胞与成骨龛黏附及其迁移的影响2.1实验组:A组为应用G-CSF(50 ng/m L)组,B组应用AMD3100(10m M)组,C组为G-CSF联合AMD3100组,对照组仅加入培养基;2.2扫描电镜检测白血病细胞与成骨细胞龛相互接触的空间特征;2.3 AMD3100及/或G-CSF对SDF-1/CXCR4轴及G-CSFR的影响2.4荧光标记法BCECF-AM检测白血病细胞黏附支架的情况;2.5 Transwell迁移实验比较迁移率;3.AMD3100及G-CSF对成骨龛白血病细胞周期及化疗药物杀伤作用的影响3.1加入G-CSF及AMD3100 24小时后加入Ara-C(0.02ug/m L,0.2ug/Ml,2ug/m L)作用24小时3.2流式细胞仪比较不同培养体系对白血病细胞周期及凋亡的影响;三、研究结果:(1)3D培养体系较2D培养体系能够分泌更多的ALP和SDF-1(P<0.05)?骨髓成骨细胞促进白血病细胞停滞在静止期(P<0.05)并能减少白血病细胞自发性及Ara-C诱导的凋亡(P<0.05),含支架培养体系较2D培养体系处于G0期细胞比例更高,凋亡率更低(P<0.05)?(2)G-CSF能够减弱SDF-1的水平并能抑制CXCR4的表达(P<0.05),降低黏附率和迁移率(P<0.05),促进G0期的白血病细胞进入细胞周期,增强化疗药物的杀伤作用(当Ara-C浓度为0.20μg/ml时,G-CSF+Ara-C:16.73±1.55%;PBS+Ara-C:10.02±2%,P<0.05)?(3)AMD3100能够抑制SDF-1/CXCR4轴作用,降低黏附率和迁移率(P<0.05),动员白血病细胞远离骨髓微环境,增强化疗药物的杀伤作用(当Ara-C浓度为0.20μg/ml时,AMD3100+Ara-C:17.01±1%;PBS+Ara-C:10.02±2%,P<0.05)?(4)两者联合使用降低黏附率和迁移率的能力更强,更能增强化疗药物的杀伤作用(AMD3100+Ara-C:17.01±1%,G-CSF+Ara-C:16.73±1.55%;AMD3100+G-CSF+Ara-C:22.06±1%P<0.05)?四、研究结论:1.3D培养体系更能够促进细胞的生长,其三维结构为细胞的生长提供足够的空间。2.AMD3100和G-CSF能够扰乱成骨龛和白血病细胞的相互作用,逆转白血病耐药?3.两者联合使用较单独应用更能增强化疗药物的杀伤作用?4.上述研究提示AMD3100及G-CSF阻断仿生性成骨龛与白血病细胞间的黏附逆转白血病耐药,可能成为难治复发性AML新的治疗方法?